【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物高通量筛选及发酵，具体涉及一种基于底物修饰的高产槐糖脂菌株的高通量筛选方法及应用。
技术介绍
1、微生物的代谢网络和调控机制复杂，利用解析微生物生理机制、改造微生物代谢途径等方法设计、构建微生物工厂耗时费力。因此，在通过多类型的诱变方式构建非特异性突变库的基础上，以特定筛选指标建立高通量筛选方法来高效、快速筛选高产菌株，从而通过对基因组、转录组、代谢组分析比较高产菌株和野生型菌株之间的区别，寻找突变体高产的原因的这种方法是具有重要意义的。
2、槐糖脂是主要的生物表面活性剂，其具有的无毒、可持续性、环境友好性的特征，使它们在实际应用中表现出化学表面活性剂所不具备的优势。熊蜂生斯塔莫酵母，又称熊蜂生假丝酵母(starmerella bombicola)是现有报道中生产槐糖脂的主要菌株，发酵时主要利用葡萄糖和羟基化脂肪酸来合成槐糖脂。槐糖脂的发酵过程通常在大规模的生物反应器中进行，经由下游工艺提取纯化后应用于材料、生物医药、农业、化妆品等领域。在实际应用过程中，槐糖脂生产成本较高，通过随机突变筛选高产菌株效率低，因此，在现有研究基础下，利用高效、快速且正突变率高的诱变和高通量筛选方法来获取高产菌株是有必要的。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种基于底物修饰的高产槐糖脂菌株的高通量筛选方法及应用，通过在高通量筛选方法中融入特征性的修饰底物，将高产菌株的筛选率提高至50％以上。
2、为达到上述目的，本专利技
3、本专利技术提供了一种基于底物修饰的槐糖脂菌株的高通量筛选方法，所述方法包括如下步骤：
4、一种基于底物修饰的高产槐糖脂菌株的高通量筛选方法，包括以下步骤：
5、(1)将多株槐糖脂生产菌株接种至筛选培养基中进行发酵培养，得到混合菌株发酵液；
6、(2)将所述的混合菌株发酵液稀释涂布于固体培养基平板进行培养，培养结束后在254nm下观察菌落紫外照射情况，暗度强于出发菌的即为目标菌株(高产槐糖脂菌株)；其中，所述的固体培养基包括碳源和荧光剂，所述碳源包括修饰底物，所述的修饰底物为疏水碳源，优选为苄基硬脂酸、苄基软脂酸、苄基亚麻酸、苄基油酸和苄基芥酸中的任意一种或几种的组合，进一步优选的，所述的苄基硬脂酸、苄基软脂酸、苄基亚麻酸、苄基油酸及苄基芥酸中任意一种的合成包括如下步骤：将硬脂酸、软脂酸、亚麻酸、油酸、芥酸中的一种先后与二异丙基氨基锂和苄基氯混合反应得到混合液，将混合液层析、洗脱即得；进一步优选地，所述的修饰底物为苄基硬脂酸。
7、其中，步骤(1)中，所述的槐糖脂生产菌株为熊蜂生斯塔莫酵母(又称熊蜂生假丝酵母)starmerella bombicola。所述的多株为2个以上菌株；所述的多株槐糖脂生产菌株是由出发菌经过诱变处理得到的混合菌株。优选地，所述的出发菌为熊蜂生斯塔莫酵母starmerella bombicola xk-11，从胜利油田表层土壤中筛选所得；所述的诱变为化学诱变，诱变剂为甲基磺酸乙酯。进一步优选地，所述的诱变处理，首先将出发菌活化培养，即将-80℃条件下保藏的甘油菌用接种环在ypd平板上进行划线，倒放于25～30℃的生长培养箱中进行培养，24～48h后以2～5％v/v的接种量转接至液体ypd培养基中，并于25～30℃，100～300r/min摇床培养12～24h，即得活化菌液。接着将所述活化菌液用磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液洗涤2～4次，缓冲液重悬菌体后，加入1～6％v/v不同剂量的甲基磺酸乙酯试剂，在25～30℃、200r/min摇床反应10～60min，反应后立刻用0.5～5％v/v的硫代硫酸钠溶液以终止反应并解除毒性，去离子水洗涤重悬，重复2～4次。诱变后菌株致死率为90％。进一步优选地，步骤(2)中所述的出发菌即为诱变前的出发菌，优选为熊蜂生斯塔莫酵母starmerella bombicola xk-11。
8、其中，步骤(1)中，所述的筛选培养基为含有氯丙嗪的ypd培养基，其中，氯丙嗪的浓度为10～50mg/l；优选为20mg/l，所述氯丙嗪与槐糖脂合成途径中p450酶的活性有关。
9、所述的发酵培养，培养温度为25～30℃，培养时间为12～72h。优选为30℃，72h。
10、其中，步骤(2)中，所述的稀释，稀释倍数为10～106倍；所述的培养，培养温度为25～30℃，培养时间为48～120h。优选为稀释104倍，30℃培养96h。
11、其中，步骤(2)中，所述的碳源还包括葡萄糖；所述修饰底物和所述葡萄糖的添加质量比为1：1～10，优选为1:1。
12、其中，步骤(2)中，所述的固体培养基，还包括氮源、无机盐和琼脂；
13、所述的碳源浓度为30～300g/l，优选为40～120g/l，进一步优选为60～100g/l，更优选为80g/l；
14、所述的氮源浓度为1～10g/l，所述氮源为硫酸铵、玉米浆、蛋白胨和酵母提取物中的任意一种或多种的组合，优选地，所述的氮源为酵母提取物，氮源浓度为1～5g/l，进一步优选为3g/l。
15、所述的无机盐浓度为1～3g/l，所述的无机盐为kh2po4、na2hpo4、mgso4和cacl2中的任意一种或多种的组合，；优选地，所述的无机盐为kh2po4、na2hpo4和mgso4的组合，优选无机盐浓度为2～3g/l。
16、所述的荧光剂的浓度为1～20g/l，优选为10～20g/l，进一步优选地，所述的荧光剂为zn2sio4-mn，浓度为10g/l；zn2sio4-mn用于在254nm紫外照射光下观察绿色荧光，所修饰底物具有254nm最大吸收峰，可猝灭该荧光，与周围部分形成明暗对比，当菌株利用苄基硬脂酸、苄基软脂酸、苄基亚麻酸、苄基油酸及苄基芥酸的一种或几种在胞内合成槐糖脂后，槐糖脂的结构上接入苄基，细胞自身也同样具有猝灭荧光的效果，槐糖脂含量较多则表现为暗度较强，反之。
17、进一步地，将步骤(2)筛选得到的目标菌株进行复筛，具体方法为：将所述的目标菌株纯培养物接种至96深孔板培养及发酵，经检测浓度高者即为高产槐糖脂菌株。进一步地，所述的深孔板发酵，包括如下步骤，所述深孔板采用96孔深孔板培养菌株，深度为2～3cm；48孔深孔板用于发酵，深度为4～5cm，所述深孔板发酵的步骤包括：挑取平板上的单菌落接种至装有ypd培养基的96孔深孔板中，25～30℃摇床培养12～24h，活化的菌液再以2～5％的转接量移取到48孔深孔板中，25～30℃，200r/min摇床发酵120～168h后检测槐糖脂的含量。所述48孔板发酵培养基成分除疏水底物替换为菜籽油、大豆油、油酸、玉米油、花生油的一种或几种，且无琼脂和荧光剂以外，其他成分同前面固体培养基。
18、所述的高通量筛选方法的效率提高了约55％。
19、第二方面，本专利技术提供了第一方面所述的高通量筛选方法筛选得到的高产槐糖本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于底物修饰的高产槐糖脂菌株的高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的槐糖脂生产菌株为熊蜂生斯塔莫酵母Starmerella bombicola，所述的多株为2个以上菌株；
3.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的筛选培养基为含有氯丙嗪的YPD培养基，其中，氯丙嗪的浓度为10～50mg/L；
4.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的稀释，稀释倍数为10～106倍；所述的培养，培养温度为25～30℃，培养时间为48～120h。
5.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的碳源包括葡萄糖，所述修饰底物和所述葡萄糖的添加质量比为1：1～10。
6.根据权利要求5所述的高通量筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的固体培养基，还包括氮源、无机盐和琼脂；
7.权利要求1～6任意一项所述的高通量筛选方法筛选得到的高产槐糖脂菌株。
8.
9.权利要求7或8所述的高产槐糖脂菌株在生产槐糖脂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将所述的高产槐糖脂菌株接种至发酵培养基中25～30℃发酵培养120～168h，发酵pH为6～7；所述的发酵培养基，包括碳源、氮源和无机盐；
...【技术特征摘要】
1.一种基于底物修饰的高产槐糖脂菌株的高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的槐糖脂生产菌株为熊蜂生斯塔莫酵母starmerella bombicola，所述的多株为2个以上菌株；
3.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的筛选培养基为含有氯丙嗪的ypd培养基，其中，氯丙嗪的浓度为10～50mg/l；
4.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的稀释，稀释倍数为10～106倍；所述的培养，培养温度为25～30℃，培养时间为48～120h。
5.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的碳源包括葡萄糖，所述修饰底物和所述葡萄糖的添加质量比为1：1～10...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙良，冯小海，杨燕波，张亚涛，薛健，
申请(专利权)人：轩凯生物科技滁州有限公司，
类型：发明
国别省市：
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