【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学，更具体的涉及将人脐带间充质干细胞(huc-mscs)诱导分化为胰岛类器官的技术方案构建。
技术介绍
1、1型糖尿病(type 1diabetes mellitus,t1dm)是产生胰岛素的胰岛β细胞被自身免疫反应破坏而导致内源性胰岛素分泌不足的代谢性疾病，虽然胰岛素强化治疗能在一定程度上调控血糖，但无法有效阻止糖尿病的发生发展，使得许多患者需要进行胰岛移植，但目前临床上胰岛移植面临供体短缺、移植后免疫排斥等诸多问题。
2、干细胞技术为解决上述问题提供了有效途径，有研究者将胚胎干细胞(embryonicstem cells,escs)或诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,ipscs)定向诱导分化成胰岛素分泌细胞(insulin producing cells,ipcs)用于胰岛替代治疗，但由于这两种细胞具有致瘤风险，在临床应用时存在较大风险。脐带间充质干细胞(humanumbilical cord mesenchymal stem cells,huc-mscs)是一种较为原始的成体干细胞，具备跨胚层分化潜能，且无致瘤风险。
3、目前将干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞的诱导方法均为二维的平板培养，且各实验室对于将huc-mscs定向诱导分化为ipcs的诱导培养基体系的建立尚不规范，诱导操作复杂，诱导成功率低，稳定性差，得到的ipcs数量少且胰岛素分泌功能仅为正常胰岛的1％，因此现有的在二维培养方式下将huc-mscs诱导生成ipcs的效率十分低下
技术实现思路
1、本专利技术针对目前在进行huc-mscs诱导分化为胰岛类器官时，现有的诱导技术存在的上述问题，提出一种基于huc-mscs的胰岛类器官三维诱导方案，各诱导成分均安全无毒，诱导效率高，稳定性强，可获得大量具有正常胰岛素分泌功能的成熟胰岛细胞微球。
2、本专利技术采用的技术方案如下：
3、配制如下5种培养液：
4、a液：添加有5-10ng/ml egf、0.2％bsa、0.3-0.5mm维生素c、2％fbs的dmem基础培养基；
5、b液：添加有5-10ng/ml egf、20-50ng/ml硝唑尼特、20-50ng/ml wnt-c59、1-4μmdorsomorphin、0.3-0.5mm维生素c、1％非必需氨基酸、4-6mmol/l谷氨酰胺、2％fbs的dmem基础培养基；
6、c液：添加有5-10ng/ml bfgf、20-50ng/ml硝唑尼特、20-50ng/ml wnt-c59、2-6ng/ml isx9、2-4μmol/l purmorphamine、5-7％fbs的dmem基础培养基；
7、d液：添加有5-10ng/ml bfgf、10-20μg/ml抗坏血酸、1-4μm dorsomorphin、10％fbs的dmem基础培养基：
8、e液：添加有5-10ng/ml bfgf、1-4μm dorsomorphin、10％fbs的dmem基础培养基；
9、s1、诱导形成内胚层细胞
10、将人脐带间充质干细胞置于黏附六孔板中并添加a液进行培养，其中，在a液的基础上添加激活素a(100ng/ml)、尼克酰胺(5-10mm)、以及双抗(1％)；
11、s2、诱导形成胰腺组细胞
12、将上述获得的内胚层细胞置于微孔板中形成三维的细胞微球并置于低吸附六孔板中并添加b液进行培养，其中，在b液的基础上添加尼克酰胺(5-10mm)、以及双抗(1％)；
13、s3、诱导形成胰腺内分泌祖细胞
14、将上述获得的胰腺祖细胞微球置于低吸附六孔板中并添加c液进行培养，其中，在c液的基础上添加尼克酰胺(5-10mm)、its-x(1％)以及双抗(1％)；
15、s4、诱导形成胰腺内分泌细胞
16、将上述获得的胰腺祖细胞微球置于低吸附六孔板中并添加d液进行培养，其中，在d液的基础上添加抗坏血酸(40μg/ml)its-x(1％)以及双抗(1％)；
17、s5、诱导形成成熟胰岛类器官
18、将上述获得的胰腺内分泌细胞微球置于低吸附六孔板中并添加e液进行培养，其中，在e液的基础上添加尼克酰胺(5-10mm)、exendin-4(40ng/ml)、its-x(1％)以及双抗(1％)；
19、进一步的，在诱导分化a液中培养3天，在诱导分化b液中培养4天，在诱导分化c液中培养6天，在诱导分化d液中培养4天，在诱导分化d液中培养7天，培养基每天换液。
20、与现有技术相比，本专利技术提供了一种将huc-mscs在三维培养方式下诱导分化为球形胰岛类器官的诱导方案，具有以下优势：
21、1.本专利技术将huc-mscs在三维培养方式下诱导分化为球形胰岛类器官，与传统的二维培养方式相比，显著提高了诱导效率，三维胰岛类器官c-peptide+细胞率为71.17％±0.40％，更有利于获得大量胰岛素分泌功能正常的成熟胰岛细胞微球，提供了一种更适合胰岛细胞球发育分化的培养方式。
22、2.本专利技术将huc-mscs在诱导分化过程中体系的含糖量采用从高糖到低糖，相比于诱导过程中含糖量不变的诱导方案，显著提高了三维胰岛类器官胰岛素分泌功能，在高糖(25mm)溶液刺激下释放的胰岛素量是在低糖(5.5mm)溶液刺激下释放胰岛素量的7.48倍，在高糖(25mm)溶液刺激下释放的c-肽量是在低糖(5.5mm)溶液刺激下释放c-肽量的14.43倍。
23、3.本专利技术诱导分化形成的球形胰岛类器官更接近天然胰岛的细胞球大小、β细胞的比例以及胰岛素分泌功能。
24、4.本专利技术操作简单、流程重复率高；本专利技术采用在诱导生成胰腺祖细胞阶段对人脐带间充质干细胞进行三维培养，胰岛类器官的均一性好，可重复操作性高。
25、5.本专利技术诱导分化形成的球形胰岛类器官，移植后无排斥，安全性高，具有广阔的临床应用前景。
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1.一种基于人脐带间充质干细胞的三维胰岛类器官的诱导方案，其特征在于，包括依次使用以下五种分化诱导液，其中，
2.根据权利要求1所述的诱导分化液，其特征在于，所述的三维胰岛类器官的培养方法包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的胰岛类器官体外培养方法，其特征在于：在诱导分化A液中培养3天， 在诱导分化B液中培养4天，在诱导分化C液中培养6天，在诱导分化D液中培养4天，在诱导分化D液中培养7天，培养基每天换液。
4.根据权利要求2所述的方法得到的三维胰岛细胞、微球以及类器官直接移植用于糖尿病胰岛替代治疗以及将其种植于支架材料中作为医疗器械用于临床移植。
【技术特征摘要】
1.一种基于人脐带间充质干细胞的三维胰岛类器官的诱导方案，其特征在于，包括依次使用以下五种分化诱导液，其中，
2.根据权利要求1所述的诱导分化液，其特征在于，所述的三维胰岛类器官的培养方法包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的胰岛类器官体外培养方法，其特征在于：在诱导分...
【专利技术属性】
技术研发人员：魏敏杰，杨丽，宫世强，
申请(专利权)人：辽宁医学诊疗科技研发中心有限公司，
类型：发明
国别省市：
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