【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物组学和生物信息学，具体涉及一种水体中抗生素抗性基因的绝对定量及宿主鉴定的方法。
技术介绍
1、抗生素抗性已成为全球性的公共健康挑战。抗生素的广泛使用加速了抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,args)的传播，而args能够通过水平基因转移扩散，成为水体中的新型污染物，尤其是饮用水系统中的潜在威胁。
2、当前，现有的检测方法(如定量pcr和宏基因组学)存在检测精度低、无法绝对定量和识别新型抗性基因的局限性，亟需新方法以更准确地评估args在水体环境中的丰度和传播机制。目前水体中抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,args)的检测通常依赖宏基因组学或定量pcr的相对定量方法，这些方法往往存在多个技术局限性。现有技术如定量pcr和宏基因组学的主要缺点包括：1)仅能检测已知的args，无法有效识别新型抗性基因；2)只能提供相对定量，未能考虑环境中微生物生物量的动态变化，难以精准评估抗性基因的绝对丰度，导致检测精度降低，尤其在低生物量环境下易引发偏差；3)对于环境中未培养的微生物群体缺乏有效的定量手段。因此，args在水体中的准确绝对定量仍然面临技术瓶颈。
3、通过检索，最接近的方案有：
4、一种养殖水域中抗生素抗性基因去除装置和快速检测方法：cn202311365924.7
5、一种自来水中游离态抗生素抗性基因的定量检测方法：cn202010744621.6
6、一种污水中游离态抗生素抗
7、尽管这些方案涉及到抗性基因检测，但均未提出使用流式细胞技术与宏基因组结合进行绝对定量检测和宿主分析的方法。
技术实现思路
1、为了克服现有技术中的不足，本专利技术将流式细胞术与宏基因组测序相结合，提供一种水体中抗生素抗性基因的绝对定量及宿主鉴定的方法，通过精确测量水体中微生物的绝对浓度，实现args的绝对丰度检测，同时能够识别抗性基因携带的宿主微生物，这种方法解决了现有方法的精度、广泛适用性和新型抗性基因识别的不足，极大提升了args在不同水体环境中的检测能力，特别是针对复杂环境样品中的抗性基因和宿主分析，提供更全面、准确的数据。
2、本专利技术的具体技术方案如下：
3、本专利技术提供一种水体中抗生素抗性基因的绝对定量及宿主鉴定的方法，包括如下步骤：
4、(1)通过流式细胞术测定水体微生物细胞绝对浓度；
5、(2)对水体的微生物基因组dna进行提取和测序文库构建，获得原始测序数据；
6、(3)对所述原始测序数据进行质量控制，获得高质量测序数据；
7、(4)对所述高质量测序数据进行arg分类与丰度估计，并与sarg 2.0数据库进行blastx对比，获得水体中抗生素抗性基因的相对丰度和绝对丰度，所述args的相对丰度以每个细胞的arg拷贝数表示，所述args的绝对丰度通过args的相对丰度×水体微生物细胞绝对浓度计算得到；
8、(5)使用megahit对样品进行宏基因组组装，并通过metaquast评估组装质量，通过blastx对比sarg 2.0数据库，鉴定出含arg的contig(acc)，利用kaiju对acc进行物种注释，同时用plasflow确定遗传位置，进而识别args宿主。
9、进一步地，所述流式细胞术所采用的染料选自sybr green i、sybr gold或propidium iodide，通过不同染料的流式细胞术，以适应不同的水体样品特性。
10、进一步地，对水体的微生物基因组dna进行提取之前采用0.1μm孔径的滤膜进行过滤。
11、进一步地，所述微生物基因组dna的提取采用fastdnatm50ml spin for soil试剂盒或dneasy powerwater kit试剂盒，使用不同的试剂盒提高提取效率或适应其他水体条件。
12、进一步地，所述测序文库的构建方法为：将微生物基因组dna片段随机打断为350bp长度，随后使用ultratm dna library prep kit进行文库构建。
13、进一步地，对所述原始测序数据进行质量控制的方法为：使用fastqc评估原始测序数据质量，去除质量评分低于20的序列，利用fastp修剪接头序列。
14、进一步地，使用megahit对样品进行宏基因组组装的参数为：--k-min 61--k-step8--min-contig-len 1000。
15、进一步地，用plasflow以0.7阈值确定遗传位置。
16、本专利技术的有益效果为：
17、本专利技术采用流式细胞术定量微生物细胞浓度，结合宏基因组学技术，实现了args的绝对定量和宿主鉴定，弥补了当前技术在精度和可操作性方面的不足，这一方案不仅提高了检测的灵敏度，还可更好地捕捉args的动态变化，适用于不同水体环境和水处理阶段，为水体中args的监测和防控提供了新思路。
18、相比传统的定量pcr和宏基因组测序方法，本专利技术通过结合流式细胞术和宏基因组学技术，显著提升了抗生素抗性基因的检测精度和全面性。首先，该方法能够实现args的绝对定量检测，克服了微生物浓度波动对结果的影响；其次，通过宏基因组组装和宿主分析，可识别新型抗性基因并追踪其在水体微生物群体中的传播途径；最终，这一方案不仅提高了检测效率，还能为水处理设施的运行和管理提供更有针对性的决策依据。
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1.一种水体中抗生素抗性基因的绝对定量及宿主鉴定的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流式细胞术所采用的染料选自SYBRGreen I、SYBR Gold或Propidium Iodide。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对水体的微生物基因组DNA进行提取之前采用0.1μm孔径的滤膜进行过滤。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物基因组DNA的提取采用FastDNATM50mL SPIN for Soil试剂盒或DNeasy PowerWater Kit试剂盒。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测序文库的构建方法为：将微生物基因组DNA片段随机打断为350bp长度，随后使用UltraTM DNA Library Prep Kit进行文库构建。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对所述原始测序数据进行质量控制的方法为：使用FastQC评估原始测序数据质量，去除质量评分低于20的序列，利用fastp修剪接头序列。
7.根
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用PlasFlow以0.7阈值确定遗传位置。
...【技术特征摘要】
1.一种水体中抗生素抗性基因的绝对定量及宿主鉴定的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流式细胞术所采用的染料选自sybrgreen i、sybr gold或propidium iodide。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对水体的微生物基因组dna进行提取之前采用0.1μm孔径的滤膜进行过滤。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物基因组dna的提取采用fastdnatm50ml spin for soil试剂盒或dneasy powerwater kit试剂盒。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所...
【专利技术属性】
技术研发人员：李炳，刘杰，赵仁鑫，
申请(专利权)人：清华大学深圳国际研究生院，
类型：发明
国别省市：
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