【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及真姬菇基因表达检测，具体涉及一种真姬菇rt-qpcr的内参基因及其扩增引物和应用。
技术介绍
1、实时荧光定量pcr（rt-qpcr）因其高准确性、灵敏性、快速性和经济性，已成为评估基因表达变化的重要工具，广泛应用于分子生物学研究。然而，rt-qpcr结果的可靠性受到多种因素的影响，包括初始rna质量和数量、逆转录效率、引物特异性以及扩增效率。因此，选择合适的内参基因对规范化实验数据至关重要。传统上，β-actin（actb）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（gapdh）和18s rrna等基因被广泛用作内参基因。越来越多的研究表明，这些传统的内参基因在不同生物体、组织或实验条件下的表达稳定性不足，并可能出现显著的差异表达。例如，gapdh作为参考基因的有效性好坏取决于生物体、组织、疾病和许多其他因素，18s rrna因为其高转录本丰度（不利于中低转录本的靶基因检测）和高度变异性也被认为不适宜作为内参基因录本丰度。因此，在不同组织、发育阶段和实验条件下，准确筛选与验证内参基因显得尤为重要，采用多个内参基因有助于显著提高实验结果的准确性。
2、以往的内参基因鉴定主要依赖于寻找其他物种中已知同源基因，并基于rt-qpcr获得的ct值进行评估，同时利用软件（如genorm、normfinder等）来评估其稳定性，这种方法限制了新型内参基因的发现。近年来，随着高通量测序技术的迅速发展，使用转录组数据进行内参基因的筛选与评估已成为一种前沿方法。这种方法具有覆盖整个基因组表达信息的优势，能够识别出多种潜在的内参基因，相
3、真姬菇作为一种重要的食用菌，在其生长与发育过程中涉及多种复杂的基因表达变化。准确的基因表达分析对于揭示真姬菇的生理机制、优化栽培技术以及进行遗传改良至关重要。然而，目前的传统内参基因在真姬菇不同发育阶段的稳定性有限，可能导致实验结果的偏差，进而影响研究的有效性和重复性。为此，迫切需要建立特异性强且稳定性好的真姬菇内参基因体系，以确保基因表达分析结果的准确性。这将为真姬菇的生长调控、抗逆性研究及品种改良提供重要支持，并推动相关研究的深入发展。
技术实现思路
1、为了解决上述技术问题，本专利技术提供了真姬菇rt-qpcr的内参基因及其扩增引物和应用，这些内参基因的稳定性优于现有真姬菇所使用的常见内参基因。
2、为了达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、本专利技术提供真姬菇rt-qpcr的内参基因，所述内参基因为 patpase基因、 rgtpase基因和 βelyase基因中的一种，所述 patpase基因的转录本序列如seq id no.1所示，所述 rgtpase基因的转录本序列如seq id no.2所示，所述 βelyase基因的转录本序列如seq idno.3所示。
4、本专利技术还提供上述的内参基因在真姬菇不同生长发育过程下的基因表达分析中的应用，所述内参基因为 patpase基因、 rgtpase基因或 βelyase基因。
5、上述 patpase基因的正向引物的核苷酸序列如seq id no.4所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.5所示。
6、上述 rgtpase基因的正向引物的核苷酸序列如seq id no.6所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.7所示。
7、上述 βelyase基因的正向引物的核苷酸序列如seq id no.8所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.9所示。
8、本专利技术还提供 patpase基因、 rgtpase基因和 βelyase基因共同作为内参基因在真姬菇不同生长发育过程下的基因表达分析中的应用，所述 patpase基因的转录本序列如seqid no.1所示，所述 rgtpase基因的转录本序列如seq id no.2所示，所述 βelyase基因的转录本序列如seq id no.3所示。
9、本专利技术还提供了上述真姬菇中稳定的内参基因的筛选方法，包括如下步骤：（1）通过真姬菇在不同生长发育过程的转录组数据分析筛选获得候选内参基因；
10、（2）利用真姬菇的转录组数据对候选内参基因的稳定性进行分析；
11、（3）利用rt-qpcr分析验证候选内参基因在真姬菇生长发育过程的表达稳定性。
12、进一步地，上述步骤（1）包括：（i）对转录组数据进行差异分析，保留在任何两个时期之间都没有差异的基因；（ii）根据最大差异倍数（mfc）小于3且变异系数小于0.2的标砖进一步筛选候选内参基因；（iii）最后排除假定基因、功能未知基因以及高度相似的基因家族，最终保留的基因作为候选内参基因。
13、进一步地，上述步骤（2）包括：（i）用以各候选内参基因的表达量除以其所在的转录组数据集的平均表达量，得到该候选内参基因在子实体的相对表达量；（ii）依据候选内参基因在在转录组数据中的最大差异倍数，对其稳定度进行评估；（iii）依据候选内参基因在在转录组数据中变异度，对其稳定度进行综合性评估；（iv）依据2和3对候选内参基因的稳定度进行综合性评估；（v）对候选内参基因进行基因功能分析。
14、进一步地，上述步骤（3）包括：（i）分析候选内参基因在rt-qpcr实验中的循环阈值；（ii）通过genorm和normfinder软件计算候选内参基因的稳定度。
15、本专利技术的有益效果：
16、本专利技术所述方法基于真姬菇在不同发育阶段的转录组数据，筛选出适宜的内参基因 patpase基因、 rgtpase基因和 βelyase基因。这些筛选获得的内参基因在真姬菇的各生长发育阶段均符合genorm和normfinder分析软件的稳定性阈值，表现出良好的稳定性，为真姬菇基因表达分析提供本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.真姬菇RT-qPCR的内参基因，其特征在于：所述内参基因为pATPase基因、RGTPase基因和βeLYase基因中的一种，所述pATPase基因的转录本序列如SEQ ID NO.1所示，所述RGTPase基因的转录本序列如SEQ ID NO.2所示，所述βeLYase基因的转录本序列如SEQ IDNO.3所示。
2.如权利要求1所述的内参基因在真姬菇不同生长发育过程下的基因表达分析中的应用，其特征在于：所述内参基因为pATPase基因、RGTPase基因或βeLYase基因。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述pATPase基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述RGTPase基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述βeLYase基因的正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，反向
6.pATPase基因、RGTPase基因和βeLYase基因共同作为内参基因在真姬菇不同生长发育过程下的基因表达分析中的应用，其特征在于：所述pATPase基因的转录本序列如SEQ IDNO.1所示，所述RGTPase基因的转录本序列如SEQ ID NO.2所示，所述βeLYase基因的转录本序列如SEQ ID NO.3所示。
...【技术特征摘要】
1.真姬菇rt-qpcr的内参基因，其特征在于：所述内参基因为patpase基因、rgtpase基因和βelyase基因中的一种，所述patpase基因的转录本序列如seq id no.1所示，所述rgtpase基因的转录本序列如seq id no.2所示，所述βelyase基因的转录本序列如seq idno.3所示。
2.如权利要求1所述的内参基因在真姬菇不同生长发育过程下的基因表达分析中的应用，其特征在于：所述内参基因为patpase基因、rgtpase基因或βelyase基因。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述patpase基因的正向引物的核苷酸序列如seq id no.4所示，反向引物的核苷酸序列如seq id no.5所示。
【专利技术属性】
技术研发人员：陶永新，李建，刘元贞，贠贝，柴龙浩，马鹤桐，赵艺昊，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：
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