【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及到分子生物学；具体的涉及核酸序列的建库与测序，进一步涉及基于排斥力的文库接种及后续扩增。
技术介绍
1、在生命健康，物种起源，司法鉴定等等领域，遗传信息的检出、破译以及分析发挥了重大的作用。同时更具体、更细分的领域里，遗传信息又引入了新的研究方法和新的研究结果，如表观组、宏基因组等等。此外，在一些领域中，遗传信息以载体或者编码的方式，提供了新的研究途径和高效的筛选通量，如适配体研究、新药研究、抗原检测等。总而言之，对遗传信息检测，即对核酸序列的检测，有着不断增长的需求。
2、目前在众多的核酸序列的检测方法中，市场占有率较高的是ngs测序，即下一代测序，又被称为二代测序。主流的二代测序方案中，待测试的遗传材料的制备是一个重要的环节。通常而言，遗传材料需要经过片段化处理，成为碱基数量合适的核酸文库，再通过不同的富集手段，在固体表面形成分散的位点。当单一核酸文库分子提供的信号强度不够时，会引入不同的扩增手段，将分散的位点上的每一核酸文库分子转变为复数的具有相同序列的核酸文库克隆簇。有的时候，扩增是直接在固体表面进行的；有的时候，扩增是发生在固体表面以外的某种支持物上，然后将扩增后的带有单一克隆片段的支持物固定在固体表面。这样形成了可供测序的测序芯片，得到核酸文库的序列信息。
3、通常来说测序芯片可以分为非阵列或者阵列两类。通常来说，非阵列芯片上核酸文库的克隆簇会以产生无规律的位点的形式排列，而阵列芯片则会在阵列上以规律的位点的形式排列。在非阵列芯片生成核酸文库克隆簇时，投入的文库的浓度受限于克隆簇
技术实现思路
1、因此，考虑到非阵列的芯片低廉的成本和易制性，其与阵列芯片互为补充，都有适宜的应用场景。同时考虑到现有的阵列芯片的产生单一序列的核酸文库克隆簇的方法的缺陷，本专利技术公开一种新的核酸文库制备及扩增方法，能够解决标签跳跃和稳定性降低的问题，实现同时适配非阵列和阵列芯片，以满足现有的需求。
2、具体如下：
3、一种在固体支撑物表面制备dna单链簇的方法，所述方法包括如下步骤：
4、1)提供固体支撑物和包含目标核酸片段或其同源序列的文库载体，所述固体支撑物和文库载体分别包含第一捕获序列和与其互补的第一抓手序列；
5、2)所述文库载体在固体支撑物表面占据一定的空间位置；
6、3)所述第一捕获序列和第一抓手序列互补配对，以文库载体中的目标核酸片段或其互补序列作为模板，通过聚合酶延伸或反转录延伸的方式在固体支撑物表面形成dna单链簇；
7、4)移除文库载体，获得偶联有dna单链簇的固体支撑物。
8、在本专利技术的具体实施方式中，所述固体支撑物选自非阵列的固体支撑物或者阵列的固体支撑物；优选地，所述固体支撑物是流体池的一部分。
9、在本专利技术的具体实施方式中，所述文库载体具有纳米或微米尺寸的空间结构；所述的纳米尺寸为文库载体的直径或流体力学直径小于1微米，例如10nm-900nm；所述微米尺寸为直径或流体力学直径大于1微米，例如10-500微米，优选地10-90微米，例如30、50或70微米。
10、在本专利技术的具体实施方式中，所述文库载体为目标核酸片段或其同源序列通过扩增形成纳米或微米尺寸具有一定空间结构的、类似球状而非线状的扩增产物。
11、在本专利技术的另一具体实施方式中，所述文库载体由生物分子、有机化合物、无机物或者以上物质的组合形成纳米或微米尺寸的载体，在载体表面直接或间接引入目标核酸片段或其互补序列；优选地，通过化学偶联的直接方式引入目标核酸片段或其互补序列；优选地，通过间接方式引入目标核酸片段或其互补序列，即在载体表面修饰引物，通过聚合酶延伸或反转录延伸将待测序文库转移至载体表面，从而形成文库载体。
12、在本专利技术的具体实施方式中，文库载体与阵列或者非阵列芯片表面的结合时，借助文库载体本身物理性质产生的排斥力以达到文库载体的单分散和/或文库载体之间的不同间隔距离(实现不同的接种密度)，所述物理性质选自文库载体的物理尺寸、空间位阻、流体力学排除体积、电荷性质(正电荷或负电荷)、电荷密度、亲疏水性或磁性。
13、在本专利技术的具体实施方式中，文库载体与芯片表面的结合由第一捕获序列和第一抓手序列的互补配对实现和/或电荷相互作用和/或疏水相互作用实现；
14、优选地，所述文库载体包含连接有第一捕获序列的目标核酸片段或其同源序列，和连接有第二捕获序列的目标核酸互补序列，所述固体支撑物表面同时包含与第一和第二捕获序列反向互补的第一和第二抓手序列。
15、优选地，通过调整缓冲液的ph和盐浓度以获得期待的接种密度。
16、优选地，通过多次接种以获得期待的接种密度，例如首先使用第一文库载体进行接种，然后再使用第二文库载体进行接种，第二文库载体的尺寸或电荷与第一文库载体相同或不同；优选地，可以先使用具有较大排斥能力的文库载体充分接种后，再使用具有较小排斥能力的文库载体进行接种。
17、在本专利技术的具体实施方式中，步骤2)和步骤3)同时进行；在本专利技术的另一具体实施方式中，骤2)和步骤3)先后进行；优选地，重复步骤2)达到期待的接种密度后，进行步骤3)。
18、在本专利技术的具体实施方式中，所述移除是指文库载体与第一抓手序列及延伸产物的杂交解除，从而使文库载体整体从固体支撑物表面脱离，杂交解除的方式选自改变盐度、ph、温度、溶剂相性或流速。
19、在本专利技术的具体实施方式中，在步骤1)之前还包括：s1)构建待测文库的步骤和/或s2)构建文库载体的步骤。
20、在本专利技术的具体实施方式中，步骤s2)中由核酸扩增生成文库载体。
21、优选地，通过rca滚环扩增形成文库载体；
22、优选地，通过rca-mda扩增形成文库载体；
23、可选地，在rca反应完成后，加入与rca产物互补的引物，引发mda反应，获得rca-mda产物构成的文库载体；
24、可选地，在rca反应开始前，在体系中同时加入可以与rca产物杂交的引物，获得rca-mda产物构成的文库载体；
2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种在固体支撑物表面制备DNA单链簇的方法，所述方法包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，所述文库载体具有纳米或微米尺寸的空间结构；所述的纳米尺寸为文库载体的直径或流体力学直径小于1微米，例如10nm-900nm；所述微米尺寸为直径或流体力学直径大于1微米，例如10-500微米，优选地10-90微米，例如30、50或70微米；
3.如权利要求1-2任一项所述的方法，文库载体与固体支撑物表面结合时，借助文库载体本身物理性质产生的排斥力以达到文库载体的单分散，和/或实现文库载体的不同的接种密度；所述物理性质选自文库载体的物理尺寸、空间位阻、流体力学排除体积、电荷性质、电荷密度、亲疏水性或磁性。
4.如权利要求1-3任一项所述的方法，所述移除是指文库载体与第一抓手序列及延伸产物的杂交解除，从而使文库载体整体从固体支撑物表面脱离，杂交解除的方式选自改变盐度、pH、温度、溶剂相性或流速。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，在步骤1)之前还包括：S1)构建待测文库的步骤和/或S2)构建文库载体的步骤；
6.在固体支撑物
7.在固体支撑物表面制备DNA单链簇或克隆簇的试剂盒或试剂组合，包括：
8.一种测序的方法，所述方法包括：通过权利要求6的方法在固体支撑物表面制备DNA克隆簇，然后对克隆簇进行测序；
9.测序试剂盒或试剂组合，所述试剂盒包含权利要求7所述的制备DNA克隆簇的试剂盒或试剂组合，以及测序试剂。
...【技术特征摘要】
1.一种在固体支撑物表面制备dna单链簇的方法，所述方法包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，所述文库载体具有纳米或微米尺寸的空间结构；所述的纳米尺寸为文库载体的直径或流体力学直径小于1微米，例如10nm-900nm；所述微米尺寸为直径或流体力学直径大于1微米，例如10-500微米，优选地10-90微米，例如30、50或70微米；
3.如权利要求1-2任一项所述的方法，文库载体与固体支撑物表面结合时，借助文库载体本身物理性质产生的排斥力以达到文库载体的单分散，和/或实现文库载体的不同的接种密度；所述物理性质选自文库载体的物理尺寸、空间位阻、流体力学排除体积、电荷性质、电荷密度、亲疏水性或磁性。
4.如权利要求1-3任一项所述的方法，所述移除是指文库载体与第一抓手序列及延伸产物的杂交解除，从而使文库载体整体从固体支撑物表面脱离，杂交...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢槟，谢苗嘉，桂哲，张峰阁，
申请(专利权)人：中元汇吉生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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