【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种甾体c14α羟化酶的可溶性表达载体及其构建方法和应用。
技术介绍
1、类固醇是一大类天然或合成的萜类脂质，包括胆汁酸、性激素和肾上腺皮质激素等，具有各种生理和药理活性，其在医疗领域的应用范围不断扩大，并已广泛应用于临床。近年来，已有300多种甾体分子被批准用于药物开发。根据与甾体母核相连官能团的结构差异及不同的排列方式，赋予甾体分子复杂的结构以及特定的生理功能。其中，羟化结构往往是活性甾体药物的关键官能团。因此，如何实现甾体药物的选择性羟化是合成活性甾药的关键步骤。生物催化羟基化是甾核环官能化的重要转化之一，但在有机合成中仍然是一项非常具有挑战性的任务。
2、在各种甾体羟基化位点中，c14-oh赋予甾体特殊的抗促性腺激素和溶癌生物活性。真菌细胞催化的甾体的c14羟基化反应在过去几十年中得到了广泛应用。具有14α羟基化能力的菌株最早在真菌中被发现，包括curvularia lunata,mucor piriformis,gongronella butleri,chaetomium,absidia coerulea等。直到2019年首次报道了来自cochliobolus lunatus的细胞色素p450(cytochromep450，cyp)家族蛋白p450lun，鉴定具有14α羟基化能力。将该酶与其电子传递链细胞色素p450还原酶(cytochrome p450reductase，cpr)同时在酿酒酵母中异源表达，可以将底物ad、rss转化成14α-ad、14α-rss。后续carmen
3、大肠杆菌具有生长速度快、培养基成本低、细胞密度高、易于遗传操作和对其遗传学和生理学知识广泛等优点，是外源蛋白表达的首选细菌宿主。此外，与其他真菌(如链霉菌)不同，大肠杆菌本身不具内源性的cyp蛋白，因此不会造成对外源表达cyp的干扰。然而，已报道的具备c14α羟化活性的酶均为真菌来源，为膜结合蛋白，大肠杆菌由于缺少膜结构及蛋白翻译后修饰功能，导致复杂结构的蛋白往往以包涵体的形式非功能表达。此外，由于大肠杆菌系统缺乏cyp催化羟基化反应的还原酶系统，目前尚未实现在大肠杆菌中实现c14羟化酶的可溶性表达及催化功能。
4、本专利技术致力于开发一种真菌源甾体c14羟化酶的可溶性表达方法，并通过基因工程策略构建自给自足的电子传递系统及辅酶循环系统，实现大肠杆菌底盘的功能表达及选择性羟化甾体化合物的c14羟基化，从而拓展活性甾体药物中间体的生物转化路线。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于设计提供一种甾体c14α羟化酶的可溶性表达载体及其构建方法和应用的技术方案。本专利技术为了解决真菌源膜结合cyp蛋白在大肠杆菌中不可溶的非功能表达问题，通过蛋白序列n端的截短并替代引入可溶性标签麦芽糖结合蛋白提高了cyp酶的可溶性表达，通过融合蛋白linker序列的筛选构建了分子内的电子传递系统，显著提升了羟基化反应的电子传递效率，此外耦合葡萄糖脱氢酶建立了辅酶nadph循环系统，降低了外源添加辅酶的依赖及反应成本。通过本专利技术建立的可溶性表达策略，实现了真菌来源的c14α羟化酶及其电子传递组份的可溶性表达及分子内电子传递，并通过多酶体外级联催化显著提升了c14α羟化酶的催化能力，在该体系下，产物得率显著提高。
2、本专利技术具体采用以下技术方案实现：
3、本专利技术第一方面提供了一种甾体c14α羟化酶的可溶性表达载体的构建方法，该方法将所述编码甾体c14α羟化酶的核酸序列和编码可溶性标签麦芽糖结合蛋白(mbp)的核酸序列在载体中表达，所述编码甾体c14α羟化酶的核酸序列如seq id no.1所示，所述甾体c14α羟化酶的氨基酸序列如seq id no.2所示。
4、本专利技术第二方面提供了通过上述构建方法得到的甾体c14α羟化酶的可溶性表达载体。
5、本专利技术第三方面提供了一种分子内耦合的人工电子传递系统，该人工电子传递系统通过在上述的甾体c14α羟化酶的可溶性表达载体中构建cyp-linker-cpr融合蛋白而得到，所述用于构建融合蛋白的linker序列为以下一种：
6、(1)ara；
7、(2)lpppp；
8、(3)steqsakkvrkka。
9、本专利技术第四方面提供了上述的人工电子传递系统在促进p450酶催化甾体羟基化反应中的应用。
10、本专利技术第五方面提供了一种p450酶羟基化反应的方法，该方法利用上述人工电子传递系统进行催化反应。
11、本专利技术第六方面提供了一种基因工程菌，包括大肠杆菌和转入大肠杆菌的目的基因，所述目的基因融合表达cyp-linker-cpr形式的融合蛋白。
12、本专利技术第七方面提供了一种基因工程菌在促进p450酶催化甾体羟基化反应中的应用。
13、进一步，该应用以所述基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎后提取的粗酶液或纯化后的纯酶液为催化剂，以黄体酮为底物，进行催化反应。
14、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
15、1)本专利技术建立了真菌来源的酶在大肠杆菌中的可溶性表达载体以及方法，为其他cyp酶在大肠杆菌中异源表达时获得可溶性的成分提供了一种新思路。
16、2)本专利技术通过构建分子内递氢系统，显著提升了羟基化过程的电子传递效率(提升2.5-3倍)，部分解决了p450单加氧酶催化反应中电子传递效率较低导致的整体催化速率较低的问题。
17、3)本专利技术还建立了体外多酶反应体系，结合辅酶耦合系统，p450单加氧反应中的还原力实现了高效循环，测得在10ml的反应体系中最终得到14α-oh-pg的产量为34.9mg/l，转化率为26.5％。
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1.一种甾体C14α羟化酶的可溶性表达载体的构建方法，其特征在于，将所述编码甾体C14α羟化酶的核酸序列和编码可溶性标签麦芽糖结合蛋白的核酸序列在载体中表达，所述编码甾体C14α羟化酶的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述甾体C14α羟化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.通过权利要求1所述的构建方法得到的甾体C14α羟化酶的可溶性表达载体。
3.一种分子内耦合的人工电子传递系统，其特征在于，该人工电子传递系统通过在权利要求2所述的甾体C14α羟化酶的可溶性表达载体中构建CYP-linker-CPR融合蛋白而得到，所述用于构建融合蛋白的linker序列为以下一种：
4.如权利要求3所述的人工电子传递系统在促进P450酶催化甾体羟基化反应中的应用。
5.一种P450酶羟基化反应的方法，其特征在于，利用如权利要求2所述人工电子传递系统进行催化反应。
6.一种基因工程菌，包括大肠杆菌和转入大肠杆菌的目的基因，其特征在于，所述目的基因融合表达CYP-linker-CPR形式的融合蛋白。
7.一种基
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，以所述基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎后提取的粗酶液或纯化后的纯酶液为催化剂，以黄体酮为底物，进行催化反应。
...【技术特征摘要】
1.一种甾体c14α羟化酶的可溶性表达载体的构建方法，其特征在于，将所述编码甾体c14α羟化酶的核酸序列和编码可溶性标签麦芽糖结合蛋白的核酸序列在载体中表达，所述编码甾体c14α羟化酶的核酸序列如seq id no.1所示，所述甾体c14α羟化酶的氨基酸序列如seq id no.2所示。
2.通过权利要求1所述的构建方法得到的甾体c14α羟化酶的可溶性表达载体。
3.一种分子内耦合的人工电子传递系统，其特征在于，该人工电子传递系统通过在权利要求2所述的甾体c14α羟化酶的可溶性表达载体中构建cyp-linker-cpr融合蛋白而得到，所述用于构建融合蛋白的linker序列为以下一种...
【专利技术属性】
技术研发人员：柯霞，柳志强，赵希曼，王鑫鑫，董红朵，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
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