【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，特别涉及一种牛乳铁蛋白肽包涵体的制备方法和复性方法。
技术介绍
1、利用大肠杆菌表达外源基因是基因工程法生产蛋白多肽的主要方法。由于大肠杆菌易于发酵培养、具有较完善的诱导调控表达体系，使其成为基因工程生产外源蛋白的主要系统，相较于酵母表达系统、植物细胞系统和昆虫细胞系统等其他表达体系表现出独特的简易和高效的优势，目前在基因工程药物如人胰岛素、人生长激素、促红细胞生成素(epo)等的基因工程生产中被广泛采用。
2、利用大肠杆菌表达外源蛋白最大的难题是外源蛋白在大肠杆菌细胞内大量合成时，极易聚集成不溶解性的蛋白质聚集体——包涵体。包涵体的形成往往导致目标多肽不能有效溶解而不能表现出活性，从而使生产失效。但如果针对某种蛋白多肽基因工程表达的包涵体，建立起有效的溶解和复性条件，使其溶解恢复正确的构型和发挥正常功能，则包涵体的表达反而有利于蛋白质多肽的纯化并提高生产效率。
3、牛乳铁蛋白(lactoferrin,lf)是一个80kda的铁结合性糖蛋白，存在于牛的外分泌液(乳汁)和多核淋巴细胞某些颗粒中，除具有抗菌活性外，还调节机体铁质转移、抗肿瘤及病毒等多种生物功能，并可通过调节多种细胞因子参与机体抗感染和免疫过程。牛乳铁蛋白是一种新型抗菌肽，可以作为一种很有前景的抗生素替代物应用于动物饲养。drago-serrano等将不同剂量的牛乳铁蛋白喂食感染鼠伤寒沙门氏菌的大鼠，发现牛乳铁蛋白可以降低大鼠体内鼠伤寒沙门氏菌的数量。牛乳铁蛋白的抑菌性其实是由牛乳铁肽功能片段(bovine lactofer
4、牛乳铁蛋白肽的基因工程表达已有较多的报道和专利。郭东华等在大肠杆菌中表达了牛乳铁蛋白肽lfcin b，lfcin b基因在大肠杆菌(escherichia coli)中获得了大量表达，表达蛋白以包涵体形式存在，利用tge透析液对纯化的lfcin b重组蛋白包涵体进行了复性。抑菌结果显示，复性的lfcin b重组蛋白对氨苄青霉素耐药性大肠杆菌具有良好的抑菌活性。邢军等表达了牛乳铁蛋白前121个氨基酸，获得无活性的或者无毒害作用的牛乳铁蛋白肽前体。酵母表达系统被应用于牛乳铁蛋白的表达，查向东等(cn104073511a)开展了酵母组成型表达的载体构建及表达制备，李本涛等(cn103602603a)获得了毕赤酵母表达牛乳铁蛋白肽及制备的专利，张广华等(cn117004501b)在毕赤酵母中分泌表达牛乳铁蛋白抗菌肽，王建华等(cn102408480a)也公开了专利“一种酵母表达的牛乳铁蛋白衍生抗菌片段blfa及其制备方法”。现有技术表达的牛乳铁蛋白肽，目标蛋白肽往往对宿主菌的生长产生抑制，而且蛋白产物纯化制备效率较低，制造成本相对较高。
技术实现思路
1、为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种牛乳铁蛋白肽包涵体的制备方法，该方法能够高效制备牛乳铁蛋白肽包涵体，牛乳铁蛋白肽包涵体对宿主菌的生长几乎无影响，且易于纯化，能够显著提高牛乳铁蛋白肽的生产效率，结合对牛乳铁蛋白肽包涵体建立的分离、溶解、纯化及复性方法，实现了基因工程高效生产牛乳铁蛋白肽。
2、本专利技术还提供了一种牛乳铁蛋白肽包涵体的复性方法。
3、本专利技术通过以下技术方案实现：
4、本专利技术提供一种牛乳铁蛋白肽包涵体的制备方法，所述制备方法包括：
5、基于大肠杆菌偏好密码子设计牛乳铁蛋白肽blfff 344的编码dna，以所述编码dna构建大肠杆菌诱导表达载体；
6、将所述大肠杆菌诱导表达载体转化至大肠杆菌中，获得基因工程重组表达大肠杆菌；
7、以异丙基硫代半乳糖苷诱导所述基因工程重组表达大肠杆菌高效表达所述牛乳铁蛋白肽blfff 344，表达产物形成牛乳铁蛋白肽包涵体，获得菌体混合液；
8、对所述菌体混合液进行离心，收集大肠杆菌菌体，重悬后进行破壁处理，后离心收集所述牛乳铁蛋白肽包涵体。
9、进一步的，所述基于大肠杆菌偏好密码子设计牛乳铁蛋白肽blfff 344的编码dna，以所述编码dna构建大肠杆菌诱导表达载体，具体包括：
10、基于大肠杆菌偏好密码子设计牛乳铁蛋白肽blfff 344的编码dna，将所述编码dna与线性化的载体pet进行同源重组，获得大肠杆菌诱导表达载体；
11、其中，所述牛乳铁蛋白肽blfff 344的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述编码dna的核苷酸序列如seq id no.2所示；
12、所述大肠杆菌诱导表达载体图谱如图1所示。
13、进一步的，所述将所述大肠杆菌诱导表达载体转化至大肠杆菌中，获得基因工程重组表达大肠杆菌，具体包括：
14、将所述大肠杆菌诱导表达载体转化至大肠杆菌bl21中，获得基因工程重组表达大肠杆菌。
15、进一步的，所述以异丙基硫代半乳糖苷诱导所述基因工程重组表达大肠杆菌高效表达所述牛乳铁蛋白肽blfff 344，表达产物形成牛乳铁蛋白肽包涵体，获得菌体混合液，具体包括：
16、将所述基因工程重组表达大肠杆菌接种于液体培养基中，当所述基因工程重组表达大肠杆菌生长至od600＝0.6±0.1时，控制培养温度为25±1℃，以终浓度1±0.1mmol/l加入异丙基硫代半乳糖苷，诱导所述牛乳铁蛋白肽blfff 344的高效表达，表达产物形成牛乳铁蛋白肽包涵体，获得菌体混合液。
17、进一步的，所述对所述菌体混合液进行离心，收集大肠杆菌菌体，重悬后进行破壁处理，后离心收集所述牛乳铁蛋白肽包涵体，具体包括：
18、对所述菌体混合液进行离心，去除上清液，收集大肠杆菌菌体；
19、所述大肠杆菌菌体经重悬后通过超声波进行破壁处理，获得包涵体混合液；
20、将所述包涵体混合液进行离心，去除上清液，收集沉淀物，获得牛乳铁蛋白肽包涵体。
21、基于同一专利技术构思，本专利技术提供一种牛乳铁蛋白肽包涵体的复性方法，所述方法包括：
22、将牛乳铁蛋白肽包涵体溶解于尿素溶液中，获得混合溶液；
23、所述混合溶液经凝胶过滤层析纯化，获得牛乳铁蛋白肽溶液；
24、向所述牛乳铁蛋白肽溶液中加入复性液后进行透析，获得牛乳铁蛋白肽复性溶液；
25、将所述牛乳铁蛋白肽复性溶液进行冷冻干燥，获得牛乳铁蛋白肽blfff 344。
26、其中，所述牛乳铁蛋白肽包涵体通过上述一种牛乳铁蛋白肽包涵体的制备方法制得。
27、进一步的，所述将牛乳铁蛋白肽包涵体溶解于尿素溶液中，获得混合溶液，具体包括：
28、将牛乳铁蛋白肽包涵体洗涤后加入到8.0mol/l的尿素溶液本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种牛乳铁蛋白肽包涵体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
2.根据权利要求1所述的一种牛乳铁蛋白肽包涵体的制备方法，其特征在于，所述基于大肠杆菌偏好密码子设计牛乳铁蛋白肽BlfFf 344的编码DNA，以所述编码DNA构建大肠杆菌诱导表达载体，具体包括：
3.根据权利要求1所述的一种牛乳铁蛋白肽包涵体的制备方法，其特征在于，所述将所述大肠杆菌诱导表达载体转化至大肠杆菌中，获得基因工程重组表达大肠杆菌，具体包括：
4.根据权利要求1所述的一种牛乳铁蛋白肽包涵体的制备方法，其特征在于，所述以异丙基硫代半乳糖苷诱导所述基因工程重组表达大肠杆菌高效表达所述牛乳铁蛋白肽BlfFf344，表达产物形成牛乳铁蛋白肽包涵体，获得菌体混合液，具体包括：
5.根据权利要求1所述的一种牛乳铁蛋白肽包涵体的制备方法，其特征在于，所述对所述菌体混合液进行离心，收集大肠杆菌菌体，重悬后进行破壁处理，后离心收集所述牛乳铁蛋白肽包涵体，具体包括：
6.一种牛乳铁蛋白肽包涵体的复性方法，其特征在于，所述方法包括：
7.根据权利要求
8.根据权利要求6所述的一种牛乳铁蛋白肽包涵体的复性方法，其特征在于，所述混合溶液经凝胶过滤层析纯化，获得牛乳铁蛋白肽溶液,具体包括：
9.根据权利要求6所述的一种牛乳铁蛋白肽包涵体的复性方法，其特征在于，所述向所述牛乳铁蛋白肽溶液中加入复性液后进行透析，获得牛乳铁蛋白肽复性溶液，具体包括：
10.根据权利要求9所述的一种牛乳铁蛋白肽包涵体的复性方法，其特征在于，所述向所述牛乳铁蛋白肽溶液中加入复性液后装入14KDa的透析袋中进行透析，获得牛乳铁蛋白肽复性溶液，具体包括：
...【技术特征摘要】
1.一种牛乳铁蛋白肽包涵体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
2.根据权利要求1所述的一种牛乳铁蛋白肽包涵体的制备方法，其特征在于，所述基于大肠杆菌偏好密码子设计牛乳铁蛋白肽blfff 344的编码dna，以所述编码dna构建大肠杆菌诱导表达载体，具体包括：
3.根据权利要求1所述的一种牛乳铁蛋白肽包涵体的制备方法，其特征在于，所述将所述大肠杆菌诱导表达载体转化至大肠杆菌中，获得基因工程重组表达大肠杆菌，具体包括：
4.根据权利要求1所述的一种牛乳铁蛋白肽包涵体的制备方法，其特征在于，所述以异丙基硫代半乳糖苷诱导所述基因工程重组表达大肠杆菌高效表达所述牛乳铁蛋白肽blfff344，表达产物形成牛乳铁蛋白肽包涵体，获得菌体混合液，具体包括：
5.根据权利要求1所述的一种牛乳铁蛋白肽包涵体的制备方法，其特征在于，所述对所述菌体混合液进行离心，收集大肠杆...
【专利技术属性】
技术研发人员：唐香山，张学文，滕慧，张友明，刘学良，赵燕，
申请(专利权)人：杭州龙明生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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