【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及病毒学领域，尤其涉及一种流感病毒候选疫苗株的高效筛选方法及其应用。
技术介绍
1、流感病毒(influenza virus)是重要的呼吸道病原体，感染人体可造成高热、乏力、头痛、咳嗽，引起严重的呼吸系统疾病甚至造成死亡，属于正黏病毒科(orthomyxoviridae)流感病毒属(influenza virus)，其基因组为单股负链分节段的rna片段。根据病毒功能蛋白中核蛋白(nucleoprotein，np)和基质蛋白(matrix protein，m)在抗原性上的差异，流感病毒可以划分为甲(a)、乙(b)、丙(c)、丁(d)四种型。每年甲型流感病毒和乙型流感病毒在世界范围内共同传播造成季节性大流行可导致数百万人感染，其中约29万至65万人死亡。
2、目前防治流感病毒感染最有效的办法仍然是接种疫苗，但季节性流感感染的高发以及病毒的抗原漂变导致疫苗株和流行株不匹配造成当季疫苗失效，一直是流感防治的重大难题。因为流感病毒亚型多变异快，一直以来世界各国未能建立有效的群体免疫，导致每年流感病毒都会卷土重来，持续威胁全球公共卫生安全。
3、流感病毒粒子表面由来自宿主细胞膜的脂质囊膜包裹，膜表面分别镶嵌着血凝素(hemagglutinin，ha)和神经氨酸酶(neuraminidase，na)两种糖蛋白，这两种糖蛋白即流感病毒表面的主要抗原，也是目前流感疫苗的主要有效成份。流感疫苗目前存在多种技术方案，包括灭活疫苗、减毒活疫苗、重组蛋白疫苗以及mrna疫苗等，其中最早出现也是目前应用最广泛的为灭活疫苗
4、流感病毒血凝素的产量主要受内因和外因共同影响，病毒基因组的序列决定病毒功能蛋白在复制过程中发挥作用的强弱，进而决定病毒的生长特性。病毒生长特性强，复制速度快，相同培养时间内血凝素产量就相对较高；除此之外，病毒培养的环境温度、酸碱度、溶氧比等外因也会影响病毒的生长和复制。在病毒培养环境固定的前提下，病毒毒种本身的生长特性即决定了单位时间内流感病毒血凝素的产量。
5、cn116218791a公开了一种基于体内外交叉的狂犬病毒筛选方法，该方法经过体内、外筛选后传代多次提高了病毒滴度。cn105671002a公开了一种禽流感病毒细胞高产疫苗株的构建筛选方法，该方法经过反向遗传及定点突变操作得到高产量的疫苗株；此外还有在细胞或者鸡胚上进行连续传代的有限稀释法等。
6、以上多种方法均可不同程度的提高病毒滴度和病毒产量，但在产业化应用中仍然存在多种问题：1)部分方法传代次数多，传代时间长，无法保证传代后毒种序列单一，可能发生突变导致抗原性改变；2)反向遗传技术具有一定操作门槛且成功率较低，一般反向遗传技术经过构建载体、同源重组、点突变以及拯救病毒等过程，操作步骤多、周期长、成功率低，不适合技术推广；3)体内外交叉筛选成本高，时间长，需进行动物实验，由于动物体内免疫系统的作用，病毒感染后通常会受到压力筛选易发生突变以适应个体环境，可能发生突变导致抗原性发生改变。
7、综上所述，如何快速筛选到滴度高、血凝素产量高且未发生突变的流感病毒候选疫苗株，并将其应用于流感病毒候选疫苗株建库中，已成为目前本领域亟待解决的问题之一。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种流感病毒候选疫苗株的高效筛选方法及其应用，能在极少传代次数的前提下，从母代病毒工作种子批中快速有效地筛选到具有优良生长特性及抗原产量的候选疫苗株毒种。
2、为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供了一种流感病毒候选疫苗株的高效筛选方法，所述高效筛选方法包括以下步骤：
4、(1)将待筛选的母代流感病毒使用病毒维持液进行稀释，稀释后加入含有犬肾细胞的培养板中，流感病毒吸附犬肾细胞，弃去培养板中病毒液；
5、(2)使用液体状态的维持培养基覆盖细胞表面，维持培养基冷却凝固，倒置于培养箱中培养病毒；
6、(3)挑取病毒斑点与缓冲液混合，接种于鸡胚和/或犬肾细胞中培养，获得所述流感病毒候选疫苗株。
7、为了获得具有高抗原性且无突变的流感病毒毒种，作为流感病毒候选疫苗株建库，需要减少传代次数，提高筛选效率。本专利技术提供筛选方法能在极少传代次数的前提下，从母代病毒工作种子批中快速有效地筛选到具有优良生长特性及抗原产量的候选疫苗株毒种，能够适用于大多数流感病毒的筛选。本专利技术使用的鸡胚为8～10日龄spf级鸡胚，但本专利技术不仅限于用于鸡胚疫苗生产的流感病毒疫苗候选毒种，也可用于基于细胞基质培养流感病毒的候选毒种。
8、优选地，所述流感病毒包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒或丁型流感病毒中的任意一种。
9、优选地，步骤(1)所述病毒维持液为含有0.2％～1％(例如可以是0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％等)w/v牛血清蛋白和1～5μg/ml(例如可以是1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml或5μg/ml等)胰酶的dmem培养基。
10、优选地，所述胰酶包括tpck处理过的胰酶和/或重组胰酶。
11、优选地，步骤(1)所述使用病毒维持液进行稀释具体为：使用病毒维持液进行10倍体积梯度稀释，从103倍稀释至108倍，具体为103、104、105、106、107和108。
12、优选地，步骤(1)所述含有犬肾细胞的培养板的制备方法包括：将处于对数生长期且状态良好的犬肾细胞消化后计数，以密度4×105～6×105个/孔(例如可以是4×105、4.5×105、4.8×105、5×105、5.2×105、5.5×105或6×105等)接种于6孔细胞培养板中，于35～40℃(例如可以是35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃等)含有4％～6％(例如可以是4％、4.5％、4.8％、5％、5.2％、5.5％或6％等)co2培养箱中培养18～24h(例如可以是18h、19h、20h、21h、22h、23h或24h等)至致密单层细胞，弃去培养基。
13、优选地，步骤(1)所述流感病毒吸附犬肾细胞的温度为34～37℃(例如可以是34℃、35℃、35.5℃、36℃或37℃等)，时间为1～2h(例如可以是1h、1.2h、1.4h、1.5h、1.6h、1.8h或2h等)。
14、优选地，步骤(1)所述弃去培养板中病毒液后还包括使用pbs缓冲液清洗细胞2～3次的步骤。
15、优选地，步骤(2)所述维持培养基为含有质量分数0本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种流感病毒候选疫苗株的高效筛选方法，其特征在于，所述高效筛选方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的高效筛选方法，其特征在于，所述流感病毒包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒或丁型流感病毒中的任意一种。
3.根据权利要求1或2所述的高效筛选方法，其特征在于，步骤(1)所述病毒维持液为含有0.2％～1％w/v牛血清蛋白和1～5μg/mL胰酶的DMEM培养基；
4.根据权利要求1～3任一项所述的高效筛选方法，其特征在于，步骤(2)所述维持培养基为含有质量分数0.5％～1％的琼脂糖、0.2％～1％w/v牛血清蛋白和1～5μg/mL胰酶的MEM培养基；
5.根据权利要求1～4任一项所述的高效筛选方法，其特征在于，步骤(2)所述培养病毒的条件为：于33～37℃含有4％～6％CO2培养箱中培养48～120h；
6.根据权利要求1～5任一项所述的高效筛选方法，其特征在于，步骤(3)所述挑取病毒斑点具体包括：挑取直径为1～4mm且边缘清晰病毒斑点，将固体状态的维持培养基连同底层细胞垂直分离挑出；
7.根据权
8.如权利要求1～7任一项所述的流感病毒候选疫苗株的高效筛选方法在筛选高抗原性流感病毒中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述高抗原性流感病毒表现为血凝素产量高。
10.如权利要求1～7任一项所述的流感病毒候选疫苗株的高效筛选方法在制备流感病毒疫苗中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种流感病毒候选疫苗株的高效筛选方法，其特征在于，所述高效筛选方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的高效筛选方法，其特征在于，所述流感病毒包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒或丁型流感病毒中的任意一种。
3.根据权利要求1或2所述的高效筛选方法，其特征在于，步骤(1)所述病毒维持液为含有0.2％～1％w/v牛血清蛋白和1～5μg/ml胰酶的dmem培养基；
4.根据权利要求1～3任一项所述的高效筛选方法，其特征在于，步骤(2)所述维持培养基为含有质量分数0.5％～1％的琼脂糖、0.2％～1％w/v牛血清蛋白和1～5μg/ml胰酶的mem培养基；
5.根据权利要求1～4任一项所述的高效筛选方法，其特征在于，步骤(2)所述培养病毒的条件为：于33～37℃含有4％～...
【专利技术属性】
技术研发人员：高宇，龙祝，何云芳，邓宏，李海欧，李东，
申请(专利权)人：深圳康泰生物制品股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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