【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于干细胞工程领域，具体涉及一种高效获得人脐带间充质干细胞库的制备方法。
技术介绍
1、间充质干细胞(mesenchymal stem cells,mscs)是来源于中胚层的多能成体干细胞，广泛存在于骨髓、脐带组织、脐血、外周血、脂肪等组织中，具有自我更新能力以及具备多种分化潜能，体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，且在连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。mscs具有很好的趋化特性，而且能穿透血管壁，静脉或局部注射均能自动趋化到损伤的组织部位，是一种能够治疗多种系统疾病的“实用型干细胞”，具有很高的临床研究和应用价值。根据资料显示，全球已登记的关于mscs的临床研究项目已高达一千多项。
2、脐带间充质干细胞(umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,uc-mscs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，具有更强的自我更新、高度增殖和多向分化潜能，由于免疫细胞幼稚使得免疫原性低，可异体使用不会产生免疫排斥反应。所有新生儿脐带中都含有大量干细胞，质量高且数量丰富，每1厘米脐带组织中即可分离大约150万个间充质干细胞，其分泌细胞生长因子的总量也非常高，便于扩增和传代。取材安全性高，且不涉及伦理问题，被称为“干细胞黄金资源”，及其适用于临床研究和应用，将来有望取代其他干细胞成为未来干细胞抗衰老治疗的主体。
3、然而，目前脐带mscs的培养方法仍存在一些不足之处，其中包括
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种高效获得人脐带间充质干细胞库的制备方法，具有较高的可重复性和标准化程度，能够提供统一的细胞样本质量。使用改良脐带间充质干细胞完全培养基培养所得细胞，其表面标志物检测结果符合脐带间充质干细胞的生物学特征，脐带间充质干细胞的安全性和有效性得到了保障。
2、为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
3、一种高效获得人脐带间充质干细胞库的制备方法，包括以下步骤：
4、s1：脐带间充质干细胞原代培养：
5、脐带外包装经过酒精消毒后传至无菌制备区域，在生物安全柜内将脐带置于培养皿中。使用0.9％氯化钠注射液清洗后进行酒精浸泡消毒，进行消毒处理后去除脐静脉、脐动脉及外膜，将剥离的华通氏胶剪切成约1mm3的小块，进行接种。
6、每个t182培养瓶分装2ml左右华通氏胶，并补充培养基至18ml。平置培养瓶使组织块尽量均匀分布于整个底面。接种第5天吸弃培养上清进行全量换液，接种第12天吸弃培养上清进行半量换液，继续培养至细胞融合度为80％的细胞。
7、s2：脐带间充质干细胞p0～p1代的培养：
8、拍打细胞融合度为80％的原代细胞培养瓶，将培养瓶内的培养基以及未贴壁的华通氏胶收集，离心备用；使用氯化钠注射液10ml轻轻冲洗细胞瓶1～2遍；使用重组酶消化细胞至80％细胞由梭形变为圆形并脱落，加入离心后的上清进行终止消化；将所有的细胞悬液进行离心，弃上清后加入msc完全培养基混匀，按照1.0～1.2*10^6/瓶的密度进行接种；培养3-4天后进行即可进行p1代至p2代的传代培养。
9、s3：p1～p2代的培养
10、当p1代细胞融合度达到85％以上进行收获。将培养瓶内的培养基进行收集，预留出中和消化所需要的培养基，其余回收至废液瓶。用10-15ml氯化钠注射液轻轻冲洗培养瓶1遍。使用重组酶进行消化，消化至在倒置显微镜下观察到80％细胞由梭形变为圆形并脱落，加入提前预留的培养上清终止消化；将所有的细胞悬液进行离心，弃上清后加入msc完全培养基混匀，按照1.0～1.2*10^6/瓶的密度进行接种，终体积25ml，培养3-4天后进行即可进行传代或者冻存。
11、s4：p2代脐带间充质干细胞的收获传代/冻存
12、观察p2代的细胞形态及融合度，当细胞融合度达到85％以上进行收获。细胞消化、中和、收集及传代方式与s3操作方式相同。
13、收获后p2代细胞可部分或全部进行冻存，以作mscs种子存入液氮库。将所有细胞悬液进行离心、收集，使用配制完全的冻存液将细胞浓度调整至1.1-1.3×10^7个/ml，每支冻存管添加1ml含冻存液的细胞悬液进行冻存。
14、s5：脐带间充质干细胞p2代复苏培养
15、从液氮罐中迅速取出p2代细胞冻存管，立即放入37℃水浴箱中，冻存管盖子保持在水面以上轻轻晃动，直至冻存液完全融解；将冻存管中的细胞悬液转移至50ml离心管中，用0.9％氯化钠注射液进行清洗，每t182细胞瓶培养接种细胞活细胞数为0.82～1.1*10^6/瓶，终体积25ml，培养至第3-4天进行收获传代。
16、s6：p4代脐带间充质干细胞的收获冻存
17、观察p4代的细胞形态及融合度，当细胞融合度达到85％以上进行收获。将所有细胞悬液进行离心、收集，使用配制完全的冻存液将细胞浓度调整至1.1-1.3×10^7个/ml，每支冻存管添加1ml含冻存液的细胞悬液进行冻存。
18、本专利技术技术方案的进一步改进在于：重组酶在使用前平衡至室温。
19、本专利技术技术方案的进一步改进在于：在s1中，华通氏胶小块与脐带间充质干细胞完全培养基的总体积为20ml，在保证给与组织块充足营养的前提下，方便组织块贴壁，组织块中的间充质干细胞易于爬出。由于脐带间存在个体差异，细胞爬出的时间长短不同，组织块接种后第17天若爬出的细胞量较少，可再次进行半量换液，直至细胞融合度达到80％。
20、本专利技术技术方案的进一步改进在于：在s2中，重组酶的添加量为5ml，刚爬出的细胞生长密度不均一，密度较高的区域消化时间较长，在消化过程中，5ml的重组酶方便进行晃动，便于细胞密度高的部位进行消化；贴壁的华通氏胶块经过重组酶的消化脱落至细胞悬液内，故中和后的所有细胞悬液使用100μm的细胞筛进行过滤，以保证较高的细胞纯度和更加准确的培养密度。
21、本专利技术技术方案的进一步改进在于：在s3中，将培养瓶内的培养基收集至50ml离本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高效获得人脐带间充质干细胞库的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种高效获得人脐带间充质干细胞库的制备方法，其特征在于：所述MSC完全培养基包括基础培养基、血小板裂解物、血清替代物、聚丙烯酸钠。
3.根据权利要求2所述的一种高效获得人脐带间充质干细胞库的制备方法，其特征在于：所述MSC完全培养基中血小板裂解物的浓度为：1~5%，血清替代物的浓度为0.5~2%，聚丙烯酸钠的添加量为：5~20μg/ml，余量为基础培养基，所述基础培养基包括MEMα培养基。
4.根据权利要求1所述的一种高效获得人脐带间充质干细胞库的制备方法，其特征在于：步骤S4中将所有细胞悬液进行离心、收集，使用配制完全的冻存液将细胞浓度调整至1.1-1.3×10^7个/ml，每支冻存管添加1ml含冻存液的细胞悬液进行冻存。
5.根据权利要求1所述的一种高效获得人脐带间充质干细胞库的制备方法，其特征在于：步骤S5中融解方法为将P2代细胞冻存管从液氮罐中迅速取出立即放入37℃水浴箱中，冻存管盖子保持在水面以上轻轻晃动，直至冻存液完全融解
6.根据权利要求1所述的一种高效获得人脐带间充质干细胞库的制备方法，其特征在于：步骤S6中每T182细胞瓶培养接种细胞活细胞数为1.0~1.2*10^6/瓶，终体积25ml，培养至D3天进行收获冻存。
7.根据权利要求1所述的一种高效获得人脐带间充质干细胞库的制备方法，其特征在于：步骤S7中将所有细胞悬液进行离心、收集，使用配制完全的冻存液将细胞浓度调整至1.1-1.3×10^7个/ml，每支冻存管添加1ml含冻存液的细胞悬液进行冻存。
8.根据权利要求1所述的一种高效获得人脐带间充质干细胞库的制备方法，其特征在于：重组酶在使用前平衡至室温。
9.根据权利要求1所述的一种高效获得人脐带间充质干细胞库的制备方法，其特征在于：步骤S6中新鲜消化、收集的MSCs传代后贴壁、增殖情况较好，每T182细胞瓶培养接种细胞活细胞数为1.0~1.2*10^6/瓶，终体积25ml，培养至D3天进行收获冻存。
10.根据权利要求1所述的一种高效获得人脐带间充质干细胞库的制备方法，其特征在于：脐带间充质干细胞冻存液包括10%DMSO、30%人血白蛋白、60%MSC完全培养基，配制完成后放置4℃进行预冷。
...【技术特征摘要】
1.一种高效获得人脐带间充质干细胞库的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种高效获得人脐带间充质干细胞库的制备方法，其特征在于：所述msc完全培养基包括基础培养基、血小板裂解物、血清替代物、聚丙烯酸钠。
3.根据权利要求2所述的一种高效获得人脐带间充质干细胞库的制备方法，其特征在于：所述msc完全培养基中血小板裂解物的浓度为：1~5%，血清替代物的浓度为0.5~2%，聚丙烯酸钠的添加量为：5~20μg/ml，余量为基础培养基，所述基础培养基包括memα培养基。
4.根据权利要求1所述的一种高效获得人脐带间充质干细胞库的制备方法，其特征在于：步骤s4中将所有细胞悬液进行离心、收集，使用配制完全的冻存液将细胞浓度调整至1.1-1.3×10^7个/ml，每支冻存管添加1ml含冻存液的细胞悬液进行冻存。
5.根据权利要求1所述的一种高效获得人脐带间充质干细胞库的制备方法，其特征在于：步骤s5中融解方法为将p2代细胞冻存管从液氮罐中迅速取出立即放入37℃水浴箱中，冻存管盖子保持在水面以上轻轻晃动，直至冻存液完全融解。
6.根据权利要求1...
【专利技术属性】
技术研发人员：薛玲，刘羡，
申请(专利权)人：河北北冥生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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