【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，尤其涉及一种基于流式细胞术构建prmt4基因敲除细胞系的方法。
技术介绍
1、蛋白质精氨酸甲基转移酶4，也称为carm1，是一种蛋白质精氨酸甲基转移酶，主要负责催化蛋白质中精氨酸残基的单甲基化和不对称二甲基化。它在多种细胞生理活动中发挥关键调控作用，包括转录调控、dna损伤应答、rna剪接、细胞周期调控以及细胞分化等。prmt4在多种癌症中的作用被广泛研究，例如：在乳腺癌中，prmt4通过高度甲基化nurd染色质重塑复合物成员gatad2a/b，促进细胞周期相关基因的表达，从而推动乳腺癌的发展。在肝癌中，prmt4通过激活akt/mtor信号通路，促进癌细胞的增殖、迁移和侵袭。此外，prmt4在白血病干细胞的自我更新中也起到重要作用，通过调节蛋白质合成，维持白血病干细胞的干性。研究表明，prmt4在顺铂诱导的急性肾损伤中发挥保护作用。prmt4通过与ncoa4相互作用，抑制铁蛋白自噬，从而减轻氧化应激和细胞死亡。在阿霉素诱导的心肌病中，prmt4通过抑制nrf2/gpx4信号通路，促进铁死亡，从而加重心肌损伤。prmt4在急性肺损伤中的作用也受到关注。细菌内毒素通过降低scffbxo9水平，稳定prmt4蛋白，从而触发肺上皮细胞死亡。
2、crispr/cas9是一种应用广泛的基因编辑的技术，其基本原理是通过guide rna(grna)引导cas9蛋白到特定的dna序列上，进行切割，然后通过细胞内的修复机制实现基因的敲除或插入。在构建敲除细胞系中，其具有高效性、精确性、灵活性、可扩展性、简单
3、目前，尚未见有关利用crispr/cas9系统敲除prmt4基因的报道，因此有必要基于crispr/cas9系统研究一种构建prmt4基因敲除细胞系的方法，并用流式细胞术快速筛选出prmt4基因敲除细胞。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种基于流式细胞术构建prmt4基因敲除细胞系的方法。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：
3、一种基于流式细胞术构建prmt4基因敲除细胞系的方法，包括如下步骤：
4、s1：guide rna的设计和合成；
5、s2：重组质粒的构建；
6、s3：病毒的包装；
7、s4：细胞系的感染；
8、s5：流式细胞术分选阳性细胞；
9、s6：分选后的单细胞培养；
10、s7：测序验证敲除情况；
11、s8：wb检测验证敲除ch12f3细胞系中prmt4蛋白的表达情况。
12、优选的：所述s1中：
13、基因名称：histone arginine methyltransferase prmt4/carm1
14、gene id:59035
15、guide rna的设计和合成包括：
16、s11：guide rna的选取：tagagctgttcatcagtgaa；
17、s12：合成guide rna引物：设计两条guide rna引物，并使其形成带bsmbi-v2限制性核酸内切酶的黏性末端，送生工生物合成单核苷酸链；具体如下：
18、sgmp4_1f：5’-caccgtagagctgttcatcagtgaa-3’
19、sgmp4_1r：5’-aaacttcactgatgaacagctctac-3’。
20、优选的：所述s2中，重组质粒的构建包括：
21、s21：crispr质粒载体的酶切
22、配制30μl酶切反应体系
23、pl-crispr-efs-gfp质粒：20μl
24、bsmbi-v2：1μl
25、10×cutsmart buffer：3μl
26、pcr grade water：6μl
27、使用pcr仪55℃恒温酶切2-3h后，用1％的琼脂糖胶进行琼脂糖凝胶电泳，然后切下含目的大小条带的胶块，用琼脂糖胶回收试剂盒对酶切好的载体进行回收纯化；
28、s22：guide rna引物的退火
29、配制退火引物复合物体系：
30、100μm forward primer：11.25μl
31、100μm reverse primer：11.25μl
32、10×annealing buffer：2.5μl
33、其中：10×annealing buffer含1m nacl和100mm tris-hcl；
34、取2l烧杯装入800ml ddh2o，在电热加热器上加热至95℃以上，将配好的退火引物复合物体系插在浮漂上，放入热水中，加热3min，模拟pcr变性过程，使得引物充分变为单链核苷酸序列，然后关闭加热器，使引物缓慢退火成带黏性末端的dna双链，降温至20-30℃；
35、退火完成后，用0.5×的annealing buffer将退火好的引物按1:400的比例稀释备用；
36、s23：将酶切好的载体和稀释后的退火引物连接在一起；
37、配制10μl连接体系
38、20-40ng vector：1.3μl
39、diluted and annealed oligo：1μl
40、10×t4 dna ligase buffer：1μl
41、t4 dna ligase：1μl
42、pcr grade water：6.2μl
43、室温孵育30min；
44、s24：转化；
45、取5μl的连接产物加入到50μl感受态细胞中,轻轻吹打混匀后冰浴30min，然后42℃水浴激活1min30s，再冰浴3min后，加入500μl不带任何抗性的lb液体培养基37℃振荡培养1h；瞬时离心之后，弃去部分上清，将剩下的部分重悬起来均匀涂布到lb平板上，37℃恒温培养箱过夜培养；
46、s25：测序；
47、每个板挑取3个单克隆进行增菌培养至少6h，进行测序；待结果出来后，将构建成功的质粒进行扩大本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于流式细胞术构建PRMT4基因敲除细胞系的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种基于流式细胞术构建PRMT4基因敲除细胞系的方法，其特征在于，所述S1中：
3.根据权利要求2所述的一种基于流式细胞术构建PRMT4基因敲除细胞系的方法，其特征在于，所述S2中，重组质粒的构建包括：
4.根据权利要求3所述的一种基于流式细胞术构建PRMT4基因敲除细胞系的方法，其特征在于，所述S3中，病毒的包装包括：
5.根据权利要求4所述的一种基于流式细胞术构建PRMT4基因敲除细胞系的方法，其特征在于，所述S32中，质粒转染包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的一种基于流式细胞术构建PRMT4基因敲除细胞系的方法，其特征在于，所述S4中，细胞系的感染包括：
7.根据权利要求6所述的一种基于流式细胞术构建PRMT4基因敲除细胞系的方法，其特征在于，所述S5中，流式细胞术分选阳性细胞包括：
8.根据权利要求7所述的一种基于流式细胞术构建PRMT4基因敲除细胞系的方法，其特征在于，所述
9.根据权利要求8所述的一种基于流式细胞术构建PRMT4基因敲除细胞系的方法，其特征在于，所述S7中，测序验证敲除情况包括：
10.根据权利要求1所述的一种基于流式细胞术构建PRMT4基因敲除细胞系的方法，其特征在于，所述S8中，WB检测验证敲除CH12F3细胞系中PRMT4蛋白的表达情况，包括：
...【技术特征摘要】
1.一种基于流式细胞术构建prmt4基因敲除细胞系的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种基于流式细胞术构建prmt4基因敲除细胞系的方法，其特征在于，所述s1中：
3.根据权利要求2所述的一种基于流式细胞术构建prmt4基因敲除细胞系的方法，其特征在于，所述s2中，重组质粒的构建包括：
4.根据权利要求3所述的一种基于流式细胞术构建prmt4基因敲除细胞系的方法，其特征在于，所述s3中，病毒的包装包括：
5.根据权利要求4所述的一种基于流式细胞术构建prmt4基因敲除细胞系的方法，其特征在于，所述s32中，质粒转染包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的一种基于流式细胞术构建prmt...
【专利技术属性】
技术研发人员：施琼，肖中姚，应正宙，
申请(专利权)人：重庆医科大学国际体外诊断研究院，
类型：发明
国别省市：
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