【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞共培养，涉及一种肌内脂肪形成机制分析方法、调控因子及评估方法。
技术介绍
1、随着消费者对高品质牛肉需求的持续增长，优化脂肪沉积和提升肉质已成为畜牧业研究的核心议题。肌内脂肪(imf)被认为是影响肉质的关键质量指标。imf的形成涉及牛脂肪细胞(bads)和牛骨骼肌细胞(bsmcs)的复杂分化过程，这两种细胞均源自中胚层的间充质干细胞(mscs)。传统单细胞培养系统无法准确复制体内发生的动态细胞间相互作用，阻碍了对bads和bsmcs之间复杂交流的全面理解。为了解决这一限制，目前的研究采用了细胞培养插入装置(transwell)共培养系统来更好地模拟这些细胞类型之间的生理相互作用。
2、一方面，在建立共培养模型时，维持理想的细胞比率和微环境平衡是一个技术挑战，不同细胞类型在存活和生长率上的差异可能导致模型的不稳定，此外，共培养系统的介质要求复杂，且细胞间的相互作用可能会影响实验结果的稳定性和可重复性。另一方面，目前对于肌内脂肪形成机制，尚处于研究阶段，亟待对其进行进一步的解读。
技术实现思路
1、针对上述问题，本专利技术提出了一种肌内脂肪形成机制分析方法、调控因子及评估方法，很好地解决了现有技术中的问题。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
3、一种肌内脂肪形成机制分析方法，包括：
4、s1、构建牛脂肪细胞与骨骼肌细胞的共培养系统，模拟体内微环境，对牛脂肪细胞与骨骼肌细胞进行共培养，观察细胞间相互作用
5、s2、对共培养的脂肪细胞与对照组的脂肪细胞进行全转录组测序，结合kegg通路富集分析差异信号通路。
6、s3、通过激活剂与抑制剂药物干预，分别激活与抑制差异信号通路，观察脂肪细胞分化情况；
7、s4、评估差异信号通路在脂肪分化中的作用。
8、可选地，所述s1包括：
9、s11、将牛脂肪细胞和骨骼肌细胞以1：2的比例接种，脂肪细胞置于细胞培养插入装置插入件的上层室，骨骼肌细胞置于下层室，均使用含10％fbs的高糖型dmem培养基培养液；
10、s12、待细胞贴壁后，将细胞培养插入装置上下室进行组装开始共培养，并在37℃、5％c02培养箱中继续维持；
11、s13、待细胞长满后，收集细胞进行总rna和蛋白提取；
12、s14、再次进行步骤s11，待两种细胞长满后，对两种细胞类型分别进行诱导分化，牛骨骼肌细胞使用骨骼肌分化培养基进行诱导分化，每2d更换一次诱导分化培养液；
13、s15、待牛骨骼肌细胞诱导分化第4d时，使用脂肪分化培养基对牛脂肪细胞进行诱导分化，诱导分化2d后，更换为维持培养基继续培养，期间每2d更换一次维持培养液；
14、s16、待牛骨骼肌细胞分化第8d时，牛脂肪细胞分化第4d时，组装细胞培养插入装置上下室，继续进行4天的共培养，使用含5％fbs的高糖型dmem培养基培养液，期间每2d更换一次培养液；
15、s17、待共培养期结束后，收集细胞进行总rna和蛋白提取；
16、s18、设立对照组，脂肪细胞以与s11中相同的条件和密度，接种在细胞培养插入装置插入件的上层室，下层室仅设置培养基，培养过程与s11-s17相同。
17、可选地，所述s13还包括待细胞长满后，通过edu染色、流式细胞术、qpcr和wb检测牛脂肪细胞的增殖效果；所述s17还包括待共培养期结束后，使用油红0、bodipy、nile red染色、tg测定、qpcr和wb检测共培养牛脂肪细胞的分化效果。
18、一种调控因子，所述调控因子为上述的脂肪细胞的调控因子，所述调控因子为溶酶体信号通路。
19、一种评估方法，所述评估方法为上述的一种调控因子的评估方法：包括
20、a、确定步骤s2中的激活剂与抑制剂的浓度；
21、b、在激活剂或抑制剂处理4d后，收集牛脂肪细胞，利用qpcr检测溶酶体信号通路和自噬相关基因的表达情况；
22、c、在激活剂或抑制剂处理4d后，弃去培养基，pbs洗涤后对细胞进行固定，利用油红o、bodipy、nile red染色对细胞成脂情况进行检测；
23、d、在激活剂或抑制剂处理4d后，收集牛脂肪细胞并提取rna，利用qpcr检测成脂相关基因的表达情况；
24、e、在激活剂或抑制剂处理4d后，收集牛脂肪细胞并提取蛋白，利用wb检测成脂相关蛋白磷酸化表达情况。
25、可选地，所述步骤a包括：
26、a1、将牛脂肪细胞在37℃、5％c02条件下培养至70-80％融合度，弃去培养基，用pba清洗细胞，更换新的完全培养基；
27、a2、设计激活剂或抑制剂的浓度梯度，每个浓度组设置三个复孔；
28、a3、根据设计的浓度梯度，将激活剂或抑制剂分别稀释至相应的工作浓度，将牛脂肪细胞分为对照组和不同浓度的药物处理组，每组约1×10^5细胞/孔，向各组添加相应浓度的激活剂或抑制剂，摇动培养板使药物均匀分布，待细胞长满后，对脂肪细胞进行诱导分化，每两天更换一次含药物的细胞诱导分化培养液；
29、a4、在诱导分化4d后，收集各组细胞，提取总rna，使用qpcr试剂盒进行cdna合成和qpcr反应，利用特异性引物对溶酶体信号通路相关基因进行定量分析，通过比较各浓度组和时间点的qpcr结果，筛选出激活剂或抑制剂的最佳作用浓度。
30、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：本方法对肌内脂肪形成机制进行的分析，为探索在脂肪分化中有关键作用的差异信号通路提供了方法，进一步地，通过对脂肪分化中关键差异信号通路的探索，为肥胖及相关代谢性疾病的治疗提供新的靶点，便于筛选和开发新的治疗药物，为临床治疗提供新的方法。
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1.一种肌内脂肪形成机制分析方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的一种肌内脂肪形成机制分析方法，其特征在于，所述S1包括：
3.根据权利要求2所述的一种肌内脂肪形成机制的实验方法，其特征在于：所述S13还包括待细胞长满后，通过EdU染色、流式细胞术、qPCR和WB检测牛脂肪细胞的增殖效果；所述S17还包括待共培养期结束后，使用油红O、BODIPY、Nile Red染色、TG测定、qPCR和WB检测共培养牛脂肪细胞的分化效果。
4.一种调控因子，所述调控因子为权利要求1中一种肌内脂肪形成机制分析方法中脂肪细胞的调控因子，其特征在于：所述调控因子为溶酶体信号通路。
5.一种评估方法，所述评估方法为权利要求4所述的一种调控因子的评估方法：包括
6.根据权利要求5所述的一种评估方法，其特征在于，所述步骤A包括：
【技术特征摘要】
1.一种肌内脂肪形成机制分析方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的一种肌内脂肪形成机制分析方法，其特征在于，所述s1包括：
3.根据权利要求2所述的一种肌内脂肪形成机制的实验方法，其特征在于：所述s13还包括待细胞长满后，通过edu染色、流式细胞术、qpcr和wb检测牛脂肪细胞的增殖效果；所述s17还包括待共培养期结束后，使用油红o、bodipy、nil...
【专利技术属性】
技术研发人员：魏大为，宋小雨，张久盘，田平，焦若普，王锦，马云，张娟，杨炜迪，马慧，王丽，咸海龙，
申请(专利权)人：宁夏大学，
类型：发明
国别省市：
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