【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，具体涉及一种丝氨酸高产菌株的诱变和筛选技术。
技术介绍
1、l-丝氨酸（l-serine）属于非必需氨基酸，作为重要的生物试剂和药剂广泛用于食品、饲料、医药、农业和化妆品工业中。 l-丝氨酸的主要生产方法有蛋白质水解法、化学合成法、酶转化法、微生物发酵法。其中，微生物发酵法因其污染小、安全性高、成本低等优点逐渐成为最有潜力的生产方式。
2、谷氨酸棒杆菌（ corynebacterium glutamicum）作为食品级安全（generallyrecognized as safe，gras）的模式工业微生物，可用于生产包括l-丝氨酸在内的多种氨基酸。当前，谷氨酸棒杆菌中l-丝氨酸直接相关的生物合成和代谢途径已基本解析（参见附图1），葡萄糖经糖酵解反应生成重要底物 3-磷酸甘油酸，然后经过3-磷酸甘油酸脱氢酶(pgdh， sera编码)、磷酸丝氨酸转氨酶 ( psat， serc编码) 、磷酸丝氨酸磷酸酶（psp， serb编码）三步催化得到l-丝氨酸。另外，l-丝氨酸合成后主要有两条降解途径，一方面会被l-丝氨酸脱水酶（serdh， sdaa编码）降解为丙酮酸，另一方面会在丝氨酸羟甲基转移酶（shmt， glya编码）作用下脱去羟甲基生成甘氨酸。
4、相对于其他较为传统的诱变技术（如紫外诱变、亚硝基胍诱变），常压室温等离子体(atmospheric and room temperature plasma，artp)诱变育种技术是一种新型的物理诱变方法。其所采用的等离子体是一种正离子和电子密度大致相等的电离气体，含有种类丰富的活性粒子可直接或间接作用于细胞的遗传物质，从而引起多样性突变并形成大容量突变库。该方法具有操作灵活、设备简单、条件温和、安全性高、突变型多样性、诱变速度快等优点，在微生物诱变育种技术中具有广阔的应用前景。
5、cn 117305152a以野生型谷氨酸棒杆菌为基础菌株进行artp诱变，诱变菌株的发酵液中最大l-丝氨酸产量可达57.5g/l，为了提高产量，进一步采用在发酵过程中加入阳离子交换树脂的分离耦合技术，解除3-磷酸甘油酸脱氢酶的反馈抑制并避免了丝氨酸羟甲基转移酶(shmt)对l-丝氨酸向甘氨酸转化，从而获得较高的产量水平。但该工艺由于需要在发酵体系中加入阳离子交换树脂，存在操作步骤繁琐、成本高等技术问题，难以大规模生产化。
6、另外，现有的丝氨酸发酵生产工艺中，普遍存在糖酸转化率较低的问题，最高也仅为0.3g/g左右，这导致丝氨酸生产的成本居高不下。因此，选育产量高、糖酸转化率高的丝氨酸生产菌株，成为丝氨酸发酵生产的必然需求。
7、本申请以代谢工程为基础结合诱变筛选的多重选育手段是筛选产酸性能优良菌株的更为有效的方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的之一是以代谢工程为基础结合诱变选育手段获得高产丝氨酸的突变菌株。
2、为实现上述目的，本专利技术选择谷氨酸棒杆菌（ corynebacterium glutamicum）atcc13032为底盘菌株，以代谢工程为基础，通过常规基因工程技术手段对其代谢途径进行改造，增强l-丝氨酸的合成途径、阻断l-丝氨酸的降解以减少副产物积累、增强l-丝氨酸外泌，构建得到l-丝氨酸生产的基础菌株，再对基础菌株进行artp诱变，并结合类似物筛选手段进行选育，得到l-丝氨酸高产菌株。对该菌株进行发酵优化，可进一步提高菌株的l-丝氨酸产量。
3、本专利技术提供一株l-丝氨酸高产谷氨酸棒杆菌，并提供一种l-丝氨酸高产菌株的诱变和选育方法。
4、本专利技术提供一株谷氨酸棒杆菌（ corynebacterium glutamicum）。该菌株已于2024年7月1日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），分类命名为：谷氨酸棒杆菌（ corynebacterium glutamicum），保藏编号为cgmcc no. 31128。
5、本专利技术还提供一种丝氨酸高产菌株的诱变和筛选技术。
6、所述诱变技术是常压室温等离子体(atmospheric and room temperatureplasma，artp)诱变。
7、所述筛选技术是类似物筛选，所述类似物是d-serine。
8、本专利技术还提供一种丝氨酸高产菌株在丝氨酸生产中的应用。
9、本专利技术还提供一种丝氨酸的生产方法，所述方法使用丝氨酸高产菌株。
10、所述方法包括：培养所述谷氨酸棒杆菌，接种到发酵罐进行发酵培养。
11、本专利技术还提供一种发酵优化工艺。
12、本专利技术还提供一种发酵生产l-丝氨酸的发酵培养基。
13、所述发酵培养基的组成包括（l）：葡萄糖10-50 g，(nh4)2so410-50 g，kh2po4 0.2-1.0 g，k2hpo4 0.2-1.0 g，mgso4·7h2o 0.2-1.0 g，cacl2 5-20 mg，feso4·7h2o 10-50 mg，mnso4·h2o 10-50 mg，znso4·7h2o 0.5-2 mg，cuso4 0.1-0.5mg，nicl2·6h2o 0.01-0.05mg，生物素10-50 μg，维生素b1 0.5-2 mg，维生素b6 2-10 mg，ph 7.0-7.5。
14、优化的发酵培养基的组成包括（l）：葡萄糖10-50 g，(nh4)2so410-50 g，kh2po4 1-5g，k2hpo4 1-5 g，mgso4·7h2o 0.2-1 g，cacl2 5-20 mg，feso4·7h2o 10-50 mg，mnso4·h2o10-50 mg，znso4·7h2o 0.5-2 mg，cuso4 0.1-1.0 mg，nicl2·6h2o 0.01-0.05 mg，氯化胆碱0.05-0.2 g，甜菜碱0.2-1.0 g本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种谷氨酸棒杆菌 (Corynebacterium glutamicum)，其特征在于，该菌株已于2024年7月1日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.31128。
2.如权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌在生产L-丝氨酸中的应用。
3.一种L-丝氨酸的生产方法，其特征在于，培养如权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌，接种到发酵罐进行发酵培养。
4.如权利要求3所述的L-丝氨酸的生产方法，其特征在于，所述发酵培养使用的发酵培养基中包含生物素。
5.如权利要求4所述的L-丝氨酸的生产方法，其特征在于，所述发酵培养基中还包含生物碱。
6.如权利要求5所述的L-丝氨酸的生产方法，其特征在于，所述生物碱为氯化胆碱和甜菜碱。
7.如权利要求3-4任一所述的L-丝氨酸的生产方法，其特征在于，每升所述发酵培养基中含有：葡萄糖10-50 g，(NH4)2SO410-50 g，KH2PO4 0.2-1.0 g，K2HPO4 0.2-1.0 g，MgSO4·7H2O 0.2-1.0 g，CaCl2
8.如权利要求5-6任一所述的L-丝氨酸的生产方法，其特征在于，每升所述发酵培养基中含有：葡萄糖10-50 g，(NH4)2SO410-50 g，KH2PO4 1-5 g，K2HPO4 1-5 g，MgSO4·7H2O 0.2-1g，CaCl2 5-20 mg，FeSO4·7H2O 10-50 mg，MnSO4·H2O 10-50 mg，ZnSO4·7H2O 0.5-2 mg，CuSO4 0.1-0.5mg，NiCl2·6H2O 0.01-0.05 mg，氯化胆碱0.05-0.2 g，甜菜碱0.2-1.0 g，生物素50-200 μg，维生素B1 0.5-2.0 mg，维生素B6 2-10 mg。
9.如权利要求8所述的L-丝氨酸的生产方法，其特征在于，接种到发酵罐中后，温度控制在25-35℃，自动流加氨水使pH在发酵的前30-50小时稳定在7.0-7.5，溶氧维持在20-50%，当菌体生长状态基本不变时再将pH调节到6.5-7.0，溶氧降低至5-15%。
...【技术特征摘要】
1.一种谷氨酸棒杆菌 (corynebacterium glutamicum)，其特征在于，该菌株已于2024年7月1日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.31128。
2.如权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌在生产l-丝氨酸中的应用。
3.一种l-丝氨酸的生产方法，其特征在于，培养如权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌，接种到发酵罐进行发酵培养。
4.如权利要求3所述的l-丝氨酸的生产方法，其特征在于，所述发酵培养使用的发酵培养基中包含生物素。
5.如权利要求4所述的l-丝氨酸的生产方法，其特征在于，所述发酵培养基中还包含生物碱。
6.如权利要求5所述的l-丝氨酸的生产方法，其特征在于，所述生物碱为氯化胆碱和甜菜碱。
7.如权利要求3-4任一所述的l-丝氨酸的生产方法，其特征在于，每升所述发酵培养基中含有：葡萄糖10-50 g，(nh4)2so410-50 g，kh2po4 0.2-1.0 g，k2hpo4 0.2-1.0 g，mgso4·7h2o 0.2-1.0 g，cacl2 5-20 mg，feso4·7h2o 10-50 mg，mnso4·h2o 10-50 mg，zn...
【专利技术属性】
技术研发人员：郝怡，李敏，朱银壮，杨百明，金祥，
申请(专利权)人：北京量维生物科技研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：
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