【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基于编辑丹参uorf序列提高丹参植株中丹参酮含量的方法，涉及基因工程。
技术介绍
1、丹参(salvia miltiorrhiza bunge)一直被有效地用于心血管和脑血管疾病的治疗。除了其显著的药用价值外，丹参还具有生命周期短、基因组大小相对较小和遗传可转移性等特点。由于这些特性，丹参已被广泛认为是重要的模型药用植物。丹参酮类化合物是从丹参中提取的脂溶性菲醌化合物，其是通过萜类化合物的共同前体异戊烯焦磷酸(ipp)和二甲基丙烯醇焦磷酸(dmapp)的多重催化作用产生的。丹参酮的生物合成涉及三个主要阶段：甲羟戊酸(mva)途径和2-c-甲基-d-赤藓糖醇4-磷酸(mep)途径，这些途径形成前体物质；然后这些前体物质进一步被二萜合酶催化，形成碳骨架结构；最后，通过cyp450后修饰酶的催化作用，生成复杂多样的丹参酮类化合物。
2、丹参酮类化合物的制备主要包括天然来源提取和人工合成两种方法，其中，提高丹参中丹参酮含量是提高丹参酮天然来源提取效率的基础，如何通过基因工程的手段，挖掘丹参酮生物合成途径中的关键基因和其对丹参酮含量的调控机制，进而提高丹参中丹参酮的含量，是本领域技术人员亟待解决的技术问题之一。
技术实现思路
1、本专利技术提供一种dna片段在调节丹参植株中丹参酮含量中的应用。
2、本专利技术还提供靶向敲除上述dna片段的sgrna和crispr/cas9系统，及其在提高丹参植株中丹参酮含量中的应用。
3、本专利技术第一方
4、a1、核苷酸序列如seq id no:1所示的dna片段；
5、a2、核苷酸序列如seq id no:2所示的dna片段。
6、本专利技术提供的核苷酸序列如seq id no:1-2所示的dna片段包括cps1基因的上游开放阅读框(upstream open reading frame，uorf)，即seq id no:1中的第70-171位核苷酸(即seq id no:2)或者seq id no:1中的第77-154位核苷酸(即seq id no:2中的第8-85位核苷酸)，这两段dna片段均以atg起始，以taa结束，均可判定为是uorf序列。cps1基因是丹参酮生物合成途径中的关键基因，其表达水平和活性直接影响丹参酮的合成和积累。而核苷酸序列如seq id no:2所示的dna片段可以通过抑制cds的翻译来调节基因表达，因此，通过基因编辑手段解除该dna片段对于丹参cps1基因cds的翻译抑制可以提高丹参中丹参酮的含量。
7、本专利技术中丹参酮具体指丹参酮类化合物，具体包括隐丹参酮(cpt)、丹参酮i(tani)、丹参酮iia(tan iia)、二氢丹参酮i(dht)中的至少一种。
8、本专利技术第二方面提供靶向敲除上述dna片段的物质在提高丹参植株中丹参酮含量中的应用。
9、进一步地，靶向敲除上述dna片段的物质可以为crispr/cas9系统。
10、本专利技术第三方面提供靶向敲除上述dna片段的sgrna，所述sgrna1的靶标序列为seq id no:1所示核苷酸序列的第15-34位，所述sgrna2的靶标序列为seq id no:1所示核苷酸序列的175-194位。
11、本专利技术第四方面提供包括上述sgrna的crispr/cas9系统。
12、进一步地，所述crispr/cas9系统还包括cas9蛋白，cas9蛋白的氨基酸序列如seqid no:3所示。
13、本专利技术第五方面提供编码上述sgrna或者crispr/cas9系统的dna分子。
14、本专利技术第六方面提供包括上述dna分子的重组表达载体。
15、本专利技术第七方面提供包括上述重组表达载体的重组转化子。
16、进一步地，所述重组转化子为包括上述重组表达载体的重组微生物，例如农杆菌。
17、本专利技术第八方面提供上述sgrna或者crispr/cas9系统在提高丹参植株中丹参酮含量中的应用。
18、本专利技术第九方面提供一种提高丹参植株中丹参酮含量的方法，包括：
19、构建crispr/cas9系统，所述crispr/cas9系统包括靶向上述dna片段的sgrna，所述sgrna包括sgrna1和sgrna2，其中，所述sgrna1的靶标序列为seq id no:1所示核苷酸序列的第15-34位，所述sgrna2的靶标序列为seq id no:1所示核苷酸序列的175-194位；
20、使用所述crispr/cas9系统敲除受体丹参植株基因组中所述dna片段，筛选得到丹参酮含量高于受体丹参植株的阳性植株，提高丹参植株中丹参酮含量。
21、本专利技术第十方面提供一种培育高丹参酮含量的丹参植株的方法，包括：
22、构建crispr/cas9系统，所述crispr/cas9系统包括靶向上述dna片段的sgrna，所述sgrna包括sgrna1和sgrna2，其中，所述sgrna1的靶标序列为seq id no:1所示核苷酸序列的第15-34位，所述sgrna2的靶标序列为seq id no:1所示核苷酸序列的175-194位；
23、使用所述crispr/cas9系统敲除受体丹参植株基因组中上述dna片段，筛选得到丹参酮含量高于受体丹参植株的阳性丹参植株。
24、进一步地，上述阳性丹参植株的获得步骤包括：步骤1、培育得到丹参无菌苗；步骤2、设计与目标基因互补的sgrna分子，以指导cas9蛋白到达特定的基因位点；步骤3、构建表达crispr/cas9系统的重组表达载体；步骤4、利用农杆菌介导的遗传转化方法，将构建好的重组表达载体导入农杆菌中，并使用成功导入重组表达载体的农杆菌侵染来源于丹参无菌苗的叶片，利用植物组织培养技术产生转基因植株；步骤5、在t0代植株苗期提取基因组dna，通过pcr方法或基因组测序进行阳性检测，筛选出成功转化以及上述dna片段被成功敲除的植株；步骤6、对敲除植株进行后期培育。
25、本专利技术利用基因编辑技术对丹参cps1基因uorf进行敲除以获得高丹参酮含量的丹参植株，从而实现丹参酮类化合物高含量丹参植株的育种应用和丹参酮类化合物的制备提取。
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1.DNA片段在调节丹参植株中丹参酮含量中的应用，其特征在于，所述DNA片段为A1或A2中的一种：
2.靶向敲除权利要求1所述的DNA片段的物质在提高丹参植株中丹参酮含量中的应用。
3.靶向敲除权利要求1所述的DNA片段的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA包括sgRNA1和sgRNA2，其中，所述sgRNA1的靶标序列为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的第15-34位，所述sgRNA2的靶标序列为SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的175-194位。
4.包括权利要求3所述的sgRNA的CRISPR/Cas9系统。
5.编码权利要求3所述的sgRNA或者权利要求4所述的CRISPR/Cas9系统的DNA分子。
6.包括权利要求5所述的DNA分子的重组表达载体。
7.包括权利要求6所述的重组表达载体的重组转化子。
8.权利要求3所述的sgRNA或者权利要求4所述的CRISPR/Cas9系统在提高丹参植株中丹参酮含量中的应用。
9.一种提高丹参植株中丹参酮含量的方法，其特征在于，
10.一种培育丹参植株的方法，其特征在于，包括：
...【技术特征摘要】
1.dna片段在调节丹参植株中丹参酮含量中的应用，其特征在于，所述dna片段为a1或a2中的一种：
2.靶向敲除权利要求1所述的dna片段的物质在提高丹参植株中丹参酮含量中的应用。
3.靶向敲除权利要求1所述的dna片段的sgrna，其特征在于，所述sgrna包括sgrna1和sgrna2，其中，所述sgrna1的靶标序列为seq id no:1所示核苷酸序列的第15-34位，所述sgrna2的靶标序列为seq id no:1所示核苷酸序列的175-194位。
4.包括权利要求3所述的sgr...
【专利技术属性】
技术研发人员：唐克轩，邵金，黎凌，郑汉，王玉亮，孙小芬，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：
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