【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物分析检测，尤其涉及一种通用型抗aav8抗体elisa试剂盒及其抗aav8抗体的检测方法，适用于定量检测样本中抗aav8抗体浓度。
技术介绍
1、腺相关病毒(adeno-associated virus,aav)是微小病毒科家族的成员之一，是一类微小、无被膜及具有二十面体结构的病毒。病毒颗粒的直径在20～26nm之间，含有大小在4.70kb左右的线状单链dna基因组。aav可作为载体转导细胞进行长期转基因表达。迄今为止，已经分离和研究了约12种天然血清型和100多种aav变体作为基因递送载体。
2、腺相关病毒8型(adeno-associated virus 8,aav8)于2002年从罗猴的心脏中分离获得，在各种aav载体中aav8因在肝脏等组织显示了高效稳定的基因转染而受到极大关注。目前重组aav8(recombinantaav8,raav8)已经广泛应用于遗传性疾病、肿瘤、自身免疫性疾病和抗病毒的基因治疗研究。
3、抗药抗体(anti-drug antibody,ada)是指在治疗过程中，由于药物刺激机体免疫系统，导致机体产生针对药物的免疫反应，从而产生特异性针对药物的抗体。这些抗体可能会影响药物的药代动力学和药效学特性，降低药物疗效，甚至引发不良反应。
4、抗药抗体分析，贯穿于非临床阶段及临床阶段。非临床阶段的安全性评价研究试验中的免疫原性评价试验、毒代动力学试验，动物入组前，均需经过抗药抗体筛选；试验过程中需检测抗药抗体水平。非临床阶段的药代动力学试验，动物入组前，均
5、抗aav8抗体elisa试剂盒适用于快速检测血清样本中抗aav8抗体浓度，不受生物样本种属限制，为基于aav8载体的基因治疗药物的抗药抗体评价提供了一种简单、快速的检测工具。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种通用型抗aav8抗体elisa试剂盒及其抗aav8抗体的检测方法，该试剂盒适用于快速检测血清样本中抗aav8抗体浓度，不受生物样本种属限制，具有良好的线性、专属性、耐用性、精密度、准确度、检测限，以及操作简便，检测周期短(单次检测时间约3小时)等特点。
2、为了实现上述目的，本申请采用了如下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供了一种通用型抗aav8抗体elisa试剂盒，所述试剂盒包括捕获板和检测溶液，
4、所述捕获板是通过包被aav8，封闭液封闭后制备得到；
5、所述检测溶液是通过生物素标记aav8，得到生物素标记的aav8，进而使用样本稀释液配制得到。
6、在以上技术方案中，所述捕获板的制备方法包括以下步骤：
7、s11，采用2#包被液将aav8稀释成浓度为0.5×1010～2×1010vg/ml的溶液，均匀加入酶标板中，封口膜封口后放置于2～8℃孵育16～20小时；
8、s12，弃去所述酶标板中的2#包被液，洗板；
9、s13，加入3#封闭液，于25～37℃条件下封闭1～4小时；
10、s14，弃去所述酶标板中的3#封闭液，将所述酶标板放置于25～37℃条件下干燥；
11、s15，干燥完成后，包被好的所述酶标板真空包装，即得所述捕获板。
12、在以上技术方案中，所述检测溶液的制备方法为：
13、利用biotin-lc-lc-nhs可与伯氨基反应，形成稳定的、不可逆的酰胺键，从而达到对含有伯氨基的aav8进行标记的效果；
14、按照1×1013vgaav8添加6μl的10mm biotin-lc-lc-nhs溶液，于截留分子量为100kda的超滤管中进行标记，去除游离生物素，测定生物素标记物蛋白浓度，加入等体积标记物保护液，即得所述生物素标记的aav8；
15、使用所述样本稀释液将所述生物素标记的aav8稀释至1.0～4.0μg/ml的工作溶液，即得所述检测溶液。
16、在以上技术方案中，所述试剂盒还包括校准品、10×洗液、所述样本稀释液、hrp标记溶液、tmb底物显色液和终止液。
17、在以上技术方案中，所述样本稀释液的配制方法为：准确称取2.27gna2hpo4、0.54gkh2po4、16.01g nacl、0.40g kcl、40.00g蔗糖、20.00g bsa至配制容器中，加入适量超纯水，搅拌溶解，溶解后加入1.00mltween-20、1.00ml proclin 300，搅拌混匀，用超纯水定容至2.00l，使用膜孔径为0.22μm的过滤器过滤后即得。
18、在以上技术方案中，所述2#包被液的配制方法为：准确称取1.14g na2hpo4、0.27gkh2po4、8.01g nacl、0.20g kcl至配制容器中，加入适量超纯水，搅拌溶解，定容至1.00l，使用膜孔径为0.22μm的过滤器过滤后即得；
19、所述3#封闭液的配制方法为：称取1.14g na2hpo4、0.27g kh2po4、8.01gnacl、0.20g kcl、10.00g明胶至配制容器中，加入适量超纯水，搅拌溶解，溶解后加入0.50mltween-20、0.50mlproclin 300，搅拌混匀，用超纯水定容至1.00l，使用膜孔径为0.22μm的过滤器过滤后即得。
20、在以上技术方案中，所述10×洗液的配制方法为：准确称取11.36g na2hpo4、2.72gkh2po4、80.06g nacl、2.01g kcl至配制容器中，加入适量超纯水，搅拌溶解，溶解后加入5.00ml tween-20、5.00ml proclin 300，搅拌混匀，用超纯水定容至1.00l，使用膜孔径为0.22μm的过滤器过滤后即得；
21、所述校准品的配制方法为：将aav8单克隆抗体放置于2～8℃条件下进行解冻，解冻后恢复室温，振荡混匀，瞬时离心后使用样本稀释液进行梯度稀释，配制成16ng/ml的standard 1，使用standard 1配制8ng/ml的standard 2，以此类推，2倍梯度稀释配制到0.25ng/ml的standard 7，样本稀释液为0ng/ml的standard 8；
22、所述hrp标记溶液的配制方法为：准确量取300ml样本稀释液至配制容器中，加入15μl hrp标记的链霉亲和素，配制成浓度为50ng/ml的工作溶液，即得；
23、所述终止液的配制方法为：准确量取270ml超纯水至配制容器中，加入30ml的10mol/l盐酸溶液，配制成浓度为1mol/l的工作溶液，使用膜孔径为0.22μm的过滤器过滤后即得。
24、第二方面，本专利技术提供了一种抗aav8抗体的检测方法，所述检测方法采用上述试剂盒进行。
25、在以上技术方案中，所述检测方法包括以下步骤：<本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种通用型抗AAV8抗体ELISA试剂盒，所述试剂盒包括捕获板和检测溶液，其特征在于：
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于：所述捕获板的制备方法包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于：所述检测溶液的制备方法为：
4.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括校准品、10×洗液、所述样本稀释液、HRP标记溶液、TMB底物显色液和终止液。
5.根据权利要求1、3或4所述试剂盒，其特征在于：所述样本稀释液的配制方法为：准确称取2.27gNa2HPO4、0.54g KH2PO4、16.01gNaCl、0.40g KCl、40.00g蔗糖、20.00g BSA至配制容器中，加入适量超纯水，搅拌溶解，溶解后加入1.00mLTween-20、1.00mLProClin 300，搅拌混匀，用超纯水定容至2.00L，使用膜孔径为0.22μm的过滤器过滤后即得。
6.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于：
7.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于：
8.一种抗AAV8抗体的检测
9.根据权利要求8所述检测方法，其特征在于：所述检测方法包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种通用型抗aav8抗体elisa试剂盒，所述试剂盒包括捕获板和检测溶液，其特征在于：
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于：所述捕获板的制备方法包括以下步骤：
3.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于：所述检测溶液的制备方法为：
4.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括校准品、10×洗液、所述样本稀释液、hrp标记溶液、tmb底物显色液和终止液。
5.根据权利要求1、3或4所述试剂盒，其特征在于：所述样本稀释液的配制方法为：准确称取2.27gna2hpo4、0.54g kh2po4、16.01...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴涛，操德群，苏春超，胡孟军，卢孔鑫，毛馨悦，朱向莹，
申请(专利权)人：浙江恒驭生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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