【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因，涉及一种基于淬灭探针(quenching probe,qp)的血清淀粉样蛋白a1(serum amyloida 1,saa1)基因型的检测方法，包括应用于临床的试剂盒。
技术介绍
1、人类血清淀粉样蛋白a1(serum amyloid a1，saa1)是一种由104个氨基酸组成的急性期反应蛋白。其在天然状态时的分子量大约为12-14kda，其编码基因位于人类第11号染色体。早期的研究认为saa1是一种急性炎症蛋白，因为在急性炎症中，saa1在血中的浓度可升高100-1000倍。此外，saa1在生理状态下可与高密度脂蛋白(hdl)结合，在炎症期间通过调节高密度脂蛋白代谢而使其水平升高。但是，近年来大量研究表明：saa1已经不仅是传统意义上的急性期炎症蛋白，而是作为天然固有免疫的调理素，saa1可与il-6、tnf-a等炎症性细胞因子相互作用，参与调节机体的固有免疫和获得性免疫。如已经发现saa1在糖尿病、冠心病、类风湿性关节炎(ra)等慢性炎症疾病和自身免疫病的发生、发展中扮演了重要的角色。
2、基因多态性(polymorphism)是指在一个生物群体中，同时存在两种或多种不连续的变异型或基因型或等位基因，亦称遗传多态性(genetic polymorphism)或基因多态性。基因单核苷酸多态性(single nuclear polymorphism,snp)是指基因序列内的单个碱基的不同，包括单个碱基的缺失，插入和置换。人类基因多态性与疾病发生和诊断与治疗有密切的关系，多态性的变化不仅在阐明机体对
3、目前由于saa1第3外显子两处snp位点(rs1136743和rs1136747)，形成了三种saa1等位基因α、β和γ，组成了α+/+，β+/+，γ+/+，αβ，αγ和βγ共6种基因型。已有研究表明不同的saa1基因型在人群中所占的比例存在差异性。例如，yamada等对321名日本人saa1基因型的研究发现，saa1α、saa1β和saa1γ这3个等位基因在日本人中的分布频率分别为0.310，0.347，0.330。ishii等发现，在127例ra患者中，发生淀粉样变者最常见的基因型是saa1γ+/+，淀粉样沉积物的出现也和saa1γ的基因频率高度相关。而在高加索人中，淀粉样变与saa1α等位基因的频率呈正相关。有报道称地中海出血热的患者中，saa1α+/+型的发病率是其他类型的7倍。lung等发现saa1基因型与npc(nasopharyngeal carcinoma，鼻咽癌)风险较高显著相关，npc患者的β+/+基因型频率比健康个体高2倍。
4、目前saa1基因型研究普遍使用的是限制性内切酶片段长度检测(rflp)，聚合酶链式反应直接测序法(pcr direct sequencing)和等位基因特异pcr(allele-specific pcr)等。但多数方法步骤较为繁琐、复杂，不易进行大规模snp分析。并且由于saa1和saa2基因的高度同源性，在检测saa1的基因型的同时如何有效的排除saa2的干扰，也是saa1基因型检测面临的考验。因此，开发一种简便、可靠的saa1基因型检测方法，对于saa1基因型相关疾病的诊断和风险分析具有重要的临床意义。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的的缺陷，本专利技术的目的是提供一种用于saa1基因的snp位点检测从而确定基因型的试剂盒；具体而言是利用巢式pcr技术和多通道淬灭探针技术，对saa1基因型相关的2个基因多态性位点在一次反应中完成检测的方法及相应的试剂盒。
2、使用淬灭探针(quenching probe，qp)在检测目标基因的snp方面非常有效。通过添加特定的引物组，产生基因扩增反应，然后使用qp通过荧光法快速简便地检测特定基因的排列。本专利技术通过联合特异的saa1巢式pcr和针对snp的qp来检测saa1基因型，为研究和未来的临床应用提供了有力的工具。
3、本专利技术提供了一种淬灭探针，其核苷酸序列如seq id no.5和seq id no.6所示：
4、ccagacacccccaggtc(seq id no.5)
5、ctgatcacttctgcagc(seq id no.6)。
6、本专利技术还提供了一种引物序列，所述引物序列包括：
7、特异性扩增引物序列：
8、tgggaggtggaggttgcgatg(seq id no.1)
9、aggaaggagggatgaaaacactggg(seq id no.2)
10、特异性巢式引物序列：
11、ggaactatgatgctgccaaaa(seq id no.3)
12、gctcgtctccctcctgactg(seq id no.4)
13、本专利技术还提供了一种扩增体系，其包括：
14、pcr引物混合液；pcr巢式引物混合液；淬灭探针混合液；pcr反应液；模板；ddh 2o。
15、其中，所述pcr引物混合液：saa1正向引物、saa1反向引物，其引物序列如seq idno.1和seq id no.2所示；所述pcr引物混合液的终浓度为0.01-0.2μm；优选地，为0.02μm。
16、其中，所述pcr巢式引物混合液：巢式正向引物、巢式反向引物，其引物序列如seqid no.3和seq id no.4所示；所述pcr巢式引物混合液的终浓度为0.01-1.0μm；优选地，为0.2μm或0.6μm。
17、其中，所述淬灭探针混合液：qp1-fam：rs1136743、qp1-tmara：rs1136747，其引物序列如seq id no.5和seq id no.6所示；所述淬灭探针混合液的终浓度为0.01-1.0μm；优选地，为0.6μm。
18、其中，所述pcr反应液：pcr缓冲液、taq酶、dntps和mg 2+；所述pcr反应液的体积为7.0-10.0μl；优选地，为10.0μl。
19、所述pcr反应液具体指pcr缓冲液、taq酶、dntps和mg 2+及ddh 2o配制而成的溶液。
20、所述taq酶的使用量为0.1-2.0u；优选地，为2.0u。
21、所述dntps在pcr反应液(pcr体系)的终浓度为0.02-1.0μm；优选地，为0.2μm。
22、所述mg 2+的体积在pcr反应液(pcr体系)的终浓度为1.0-4.0μm；优选地，为2.5μm。
23、其中，所述模板：阳性对照或阴性对照或基因组dna；所述模板的体积为0.2-5.0μl；优选本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种淬灭探针，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示：
2.一种引物序列，其特征在于，所述引物序列包括：
3.一种扩增体系，其特征在于，其包括：
4.如权利要求1所述的淬灭探针、或如权利要求2所述的引物序列、或如权利要求3所述的扩增体系制备SNP位点检测、或SAA1基因型检测、或基因多态性检测的试剂中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种淬灭探针，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no.5和seq id no.6所示：
2.一种引物序列，其特征在于，所述引物序列包括：
3.一种扩增体系，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：张杰，施长根，张艳，张海涛，
申请(专利权)人：德赛诊断系统上海有限公司，
类型：发明
国别省市：
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