【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测中的动物疫病兽用检测，具体涉及一种用于检测腐败支原体的荧光pcr引物、探针及检测试剂盒。
技术介绍
1、传染性无乳综合征(ca)是一种具有重大后果的小反刍支原体病，该综合征包括乳腺炎和无乳症，可能伴有结膜炎和多发性关节炎。腐败支原体(mycoplasmaputrefaciens，mput)为传染性无乳综合征的病原体之一，但到目前为止，它很少受到关注，毒力属性尚不完全清楚。该物种在1974年被确认为新物种，但到目前为止，腐败支原体的鉴定仍依赖于经典的分离和鉴定技术，这使得临床检测具有很大的局限性，比如体外培养法和血清学方法均可用于检测腐败支原体。体外培养法是经典的检测方法，但耗时较长，而血清学方法灵敏度较低。目前还未见有检测腐败支原体更高灵敏度的方法，因此有必要开发一种针对腐败支原体的实时荧光pcr引物和taqman探针。
技术实现思路
1、针对现有技术中存在的问题，本专利技术基于ncbi数据库已报道的腐败支原体参考基因组设计了一套用于检测腐败支原体的荧光pcr引物和探针的组合物以及检测试剂盒，以实现对腐败支原体实施快速高灵敏度检测。
2、第一方面，本专利技术提出了一种用于检测腐败支原体(mycoplasmaputrefaciens)的荧光pcr引物和探针组合，其包括核苷酸序列如sed id no：4所示的上游引物，核苷酸序列如sed id no：6所示的下游引物，以及核苷酸序列如sed id no：5所示的探针。
3、其中，所述探针的5
4、该引物和探针组合能够对腐败支原体具有良好的特异性，且检测灵敏度高、便捷快速。
5、第二方面，本专利技术还基于引物和探针组合进一步提出了其在制备检测腐败支原体试剂盒中的应用。
6、进一步地，本专利技术提出了一种含有所述的引物和探针组合的试剂盒。
7、进一步地，所述荧光pcr检测的25μl反应体系包含：
8、hieffunicon universal taqman multiplex qpcrmaster mix 10-15μl；
9、
10、余量为depc处理水。
11、第三方面，本专利技术还进一步提出了一种试剂盒的检测腐败支原体的方法，其包括：提取腐败支原体目的基因组dna，以提取的基因组dna为模板，在所述引物和探针组合的引导下进行荧光pcr检测；用得到的ct值和出现的特异性扩增曲线对腐败支原体进行定性检测，和/或根据标准曲线和得到的ct值，计算待测样品中所含腐败支原体的拷贝数，实现定量检测。
12、优选地，荧光pcr检测的反应条件为：95℃预变性5分钟；pcr扩增95℃变性15秒，60℃延伸30秒，45个循环。
13、进一步地，所述模板为含腐败支原体arcb基因的重组质粒的标准品，标准品的浓度选自1×1010、1×109、1×108、1×107、和1×106copies/μl其中之一。
14、进一步地，将所述标准品按照10倍梯度稀释至浓度不低于1×101copies/μl，得到标准样品，以标准样品作为模板，在荧光pcr检测后，以各标准样品的浓度log值对其相应ct值作图，绘制得到标准曲线。
15、进一步地，若待测样品出现特异性扩增曲线，且ct值≤38，则结果判定为腐败支原体核酸阳性；若待测样品出现特异性扩增曲线，且38＜ct值≤40，则结果判定为腐败支原体核酸可疑，需进行复检；复检后ct值≤40且出现特异性扩增曲线，则结果判定为阳性，反之为阴性；若待测样品无ct值或无特异性扩增曲线，则结果判定为腐败支原体核酸阴性。
16、基于以上技术方案提供的用于检测腐败支原体的荧光pcr引物、探针及检测试剂盒能对腐败支原体实施快速高灵敏度检测，可为病原主要流行情况的调查、疫病的净化、菌株的筛选和质量监控提供有力依据，有效预防和控制疫病的发生。本专利技术的试剂盒和检测方法操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性好，可以实现对腐败支原体的定性检测，将在临床诊断中病料样品或培养物中腐败支原体的准确检测及疫苗制造(非诊断目的的应用)等前期技术支持发挥重要作用，应用前景广阔。
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1.一种用于检测腐败支原体(Mycoplasmaputrefaciens)的荧光PCR引物和探针组合，其特征在于，包括核苷酸序列如SED ID NO：4所示的上游引物，核苷酸序列如SED ID NO：6所示的下游引物，以及核苷酸序列如SED ID NO：5所示的探针。
2.如权利要求1所述的引物和探针组合，其特征在于，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，且所述探针的3’端经磷酸化处理；可选地，所述荧光报告基团选自FAM、HEX、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas其中一种，所述荧光淬灭基团选自TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、MGB、DABCYL其中一种。
3.如权利要求1或2所述的引物和探针组合在制备检测腐败支原体试剂盒中的应用。
4.一种含有如权利要求1或2所述的引物和探针组合的试剂盒。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光PCR检测的25μL反应体系包含：
6.一种如权利要求5所述的试剂盒的检测腐败支原体的方法，其特征在于，提取腐败支原体目的基因组DN
7.如权利要求6所述的检测腐败支原体的方法，其特征在于，荧光PCR检测的反应条件为：95℃预变性5分钟；PCR扩增95℃变性15秒，60℃延伸30秒，45个循环。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述模板为含腐败支原体arcB基因的重组质粒的标准品，标准品的浓度选自1×1010、1×109、1×108、1×107、和1×106copies/μL其中之一。
9.如权利要求8所述的检测腐败支原体的方法，其特征在于，将所述标准品按照10倍梯度稀释至浓度不低于1×101copies/μL，得到标准样品，以标准样品作为模板，在荧光PCR检测后，以各标准样品的浓度Log值对其相应Ct值作图，绘制得到标准曲线。
10.如权利要求9所述的检测腐败支原体的方法，其特征在于，若待测样品出现特异性扩增曲线，且Ct值≤38，则结果判定为腐败支原体核酸阳性；
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测腐败支原体(mycoplasmaputrefaciens)的荧光pcr引物和探针组合，其特征在于，包括核苷酸序列如sed id no：4所示的上游引物，核苷酸序列如sed id no：6所示的下游引物，以及核苷酸序列如sed id no：5所示的探针。
2.如权利要求1所述的引物和探针组合，其特征在于，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团，且所述探针的3’端经磷酸化处理；可选地，所述荧光报告基团选自fam、hex、joe、tet、cy3、cy5、rox、texas其中一种，所述荧光淬灭基团选自tamra、bhq1、bhq2、bhq3、mgb、dabcyl其中一种。
3.如权利要求1或2所述的引物和探针组合在制备检测腐败支原体试剂盒中的应用。
4.一种含有如权利要求1或2所述的引物和探针组合的试剂盒。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光pcr检测的25μl反应体系包含：
6.一种如权利要求5所述的试剂盒的检测腐败支原体的方法，其特征在于，提取腐败支原体目的基因组dna，以提取的基因组...
【专利技术属性】
技术研发人员：张博，徐丽媛，李梅，纪燕，刘玉梅，刘东霞，韩四娥，赵丽霞，关平原，
申请(专利权)人：金宇保灵生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：
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