【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞与组织培养，尤其涉及一种类器官细胞聚集实时监测及动态分析方法。
技术介绍
1、类器官是指利用干细胞(多能干细胞、胚胎干细胞或成体干细胞细胞)进行体外三维培养而形成的具有一定空间结构的组织类似物。
2、由于类器官的不透明性，现有的成像技术和分析工具往往采取终点测定的方式，如定期取样后固定样本再进行切片分析，无法跟踪类器官的发育过程或在不同条件下的变化，并且有可能导致类器官的结构或功能发生改变，从而影响到实验结果的可比性和可重复性，并且对类器官具有破坏性，实验耗时长，劳动强度高。
3、近年来，有研究者用含几十到上百个细胞的细胞聚集体而不是分散的细胞接种到胶原蛋白水凝胶中，其研究证明即使在没有补充外源性生长因子(tgf-β)的情况下，含有聚集体的生物材料在体内软骨也会快速形成。因此，细胞凝聚可以被认为是一种有效的方法来引导细胞命运，使细胞的分化能力的增强，但细胞凝聚进程无法精准监测致使后续引导分化控制难以进行。如专利cn 118421456a中该系统结合类器官培养和实时监测培养液成分，但该系统专注于将已经培养成熟的类器官接种在特殊的培养孔中，并对其进行监测，不能实时监测类器官从初期细胞聚集到成熟类器官结构的全过程，并且图像分析依赖于高内涵细胞成像仪，但现在的高内涵成像仪提供给细胞的培养环境即提供的温度和二氧化碳浓度不够稳定，而细胞聚集的早期，环境的要求非常的苛刻，经过验证在高内涵成像上，早期细胞很难从离散状态到聚集状态。因此现阶段存在的一个明显挑战是如何使用非侵入的方式动态监测和评估细胞聚集体
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于对细胞早期提供一种类器官细胞聚集实时监测及动态分析方法。为了达到以上目的，本专利技术所采用的技术方案包括以下步骤：
2、(一)细胞处理
3、(1)先用胰酶消化间充质干细胞，并用生长培养基反复冲洗培养皿收集细胞，取微量细胞悬液滴在细胞计数板上，对收集的细胞进行离心，再用软骨诱导培养基重悬为细胞悬液。
4、(2)在细胞培养板底部铺一层具有微井结构的琼脂糖，再在细胞培养板中每孔加入软骨诱导培养基，离心去除微井中的气泡。
5、(3)吸取细胞悬液加入细胞培养板，离心使细胞沉降在微井中，随后将细胞培养板放置在37℃二氧化碳恒温培养箱中进行培养。
6、(二)图像获取
7、将细胞胞培养板放置于活细胞观察仪上，调整拍摄视野，通过活细胞观察仪每间隔一定时间拍摄一张细胞聚集的明场图像。
8、(三)图像预处理
9、使用自编写python代码段每间隔一定时间实时读取步骤(二)中更新的明场图像进行预处理，对图像进行格式转换。再将原始图像裁剪为只有4个细胞聚集的区域，去除两侧区域，裁剪后的图像用otsu’s二值化方法将灰度图像转换为二值图像保留图中细胞球图像信息。
10、(四)细胞轮廓获取
11、检索细胞球轮廓：将检索到的二值图像中细胞球的外部轮廓，使用链式近似来压缩轮廓点并计算所有检测到的轮廓面积，并找到最大的轮廓面积设为max_contour_area。
12、形态学操作：再根据max_contour_area的不同，调整选择不同大小的形态学核kernel_size(结构元素)，创建一个全是1的矩形结构元素，然后选择适当的核大小用它对二值图像进行闭运算填补图像中的小空洞部分和去除噪声。
13、再次对形态学闭运算后的图像进行轮廓查找并设置一个最小轮廓面积，筛选出大于此面积的轮廓，创建新图像后绘制每张图片检测到的轮廓，并输出保存图像。
14、(五)细胞实时监测
15、将每张图中4个细胞球的轮廓数据进行平均处理，统计形态学信息变化，绘制细胞球面积、圆度、致密度随时间的变化图，确定快速凝聚期、形态稳定期、和凝聚后期，并生成了统计信息和可视化图表。
16、自编写的python程序每隔5分钟检查一次输入文件夹，通过集合差运算以检测是否有新图像文件。若发现新图像文件，python程序会调用函数来对新图像处理进行上述操作，使得程序能够自动处理不断增加的图像数据，无需手动干预，以此来达到实时监测的效果。
17、进一步地，步骤(一)中的类器官细胞来源还可以是成体干细胞和多能干细胞。进一步地，步骤(一)中的间充质干细胞还可以用神经元、成骨细胞诱导培养基来进行诱导处理。
18、进一步地，步骤(一)中的细胞悬液离心沉降时间为1-10分钟。
19、进一步地，步骤(二)中拍摄间隔时间为1-8分钟。
20、进一步地，步骤(三)中将明场图像格式由tiff格式转换为png格式。
21、进一步地，步骤(三)中的细胞轮廓提取的自编写python代码为：
22、
23、进一步地，步骤(三)中的提取轮廓性质的自编写python代码为：
24、
25、进一步地，步骤(三)中的实时监测的自编写python代码为：
26、
27、相比较于现有技术：本专利技术的技术优势在于可以自动化地监测类器官细胞聚集过程，实时处理类器官细胞聚集图像，实现从图像预处理、特征提取到数据分析和可视化提取完整过程，从明场图像中提取形态学有用信息，进行定量分析，并以图表和数据文件的形式展示。除此以外还通过pcr技术对实时动态监测系统所划分的三个时期进行验证，输出图表文件中的形态学信息与细胞基因表达变化可以形成对应解释，可以选择最佳时间进行诱导分化，说明该非侵入动态监测为细胞聚集过程提供支持，对细胞形态、聚集特征及其随时间变化的详细分析有助于理解细胞行为、评估实验条件或药物处理的效果，以研究细胞聚集的趋势和变化。
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1.一种类器官细胞聚集实时监测及动态分析方法，其特征在于包括以下步骤：(一)细胞处理
2.根据权利要求1所述的一种类器官细胞聚集实时监测及动态分析方法，其特征在于：步骤(一)中的类器官细胞来源还可以是成体干细胞和多能干细胞。
3.根据权利要求1所述的一种类器官细胞聚集实时监测及动态分析方法，其特征在于：步骤(一)中的间充质干细胞还可以用神经元、成骨细胞诱导培养基来进行诱导处理。
4.根据权利要求1所述的一种类器官细胞聚集实时监测及动态分析方法，其特征在于：步骤(一)中的细胞悬液离心沉降时间为1-10分钟。
5.根据权利要求1所述的一种类器官细胞聚集实时监测及动态分析方法，其特征在于：步骤(二)中拍摄间隔时间为1-8分钟。
6.根据权利要求1所述的一种类器官细胞聚集实时监测及动态分析方法，其特征在于：步骤(三)中将明场图像格式由TIFF格式转换为PNG格式。
7.根据权利要求1所述的一种类器官细胞聚集实时监测及动态分析方法，其特征在于：步骤(三)中的细胞轮廓提取的自编写python代码为：
8.根据
9.根据权利要求1所述的一种类器官细胞聚集实时监测及动态分析方法，其特征在于：步骤(三)中的实时监测的自编写python代码为：
...【技术特征摘要】
1.一种类器官细胞聚集实时监测及动态分析方法，其特征在于包括以下步骤：(一)细胞处理
2.根据权利要求1所述的一种类器官细胞聚集实时监测及动态分析方法，其特征在于：步骤(一)中的类器官细胞来源还可以是成体干细胞和多能干细胞。
3.根据权利要求1所述的一种类器官细胞聚集实时监测及动态分析方法，其特征在于：步骤(一)中的间充质干细胞还可以用神经元、成骨细胞诱导培养基来进行诱导处理。
4.根据权利要求1所述的一种类器官细胞聚集实时监测及动态分析方法，其特征在于：步骤(一)中的细胞悬液离心沉降时间为1-10分钟。
5.根据权利要求1所述的一种类器官细胞聚集实时监测及动态分析方法，其特...
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