【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物合成，尤其涉及用于东莨菪亭合成的菌株共培养体系及其应用。
技术介绍
1、东莨菪亭(scopoletin)，又名东莨菪亭内酯或莨菪亭，属香豆素类化合物，化学名为6-甲氧基-7羟基香豆素。该化合物广泛存在于多种植物中，如伞形科的兴安白芷、丁公藤以及烟草等。它因其具有丰富的药理活性而备受关注，包括抗肿瘤、抗炎、抗氧化、防治高尿酸血症以及抗神经退行性疾病等。在医学领域，东莨菪亭可用于治疗支气管疾病和哮喘，同时还能缓解焦虑症和抑郁症症状。尤为重要的是它对正常细胞无毒性，这一特性使其成为医药研发中极具潜力的先导化合物。通过结构修饰，如将肉桂酸引入东莨菪亭的7位或3-氨基东莨菪亭的3位，可合成得到多种对人类肿瘤细胞具有强抗肿瘤活性的东莨菪亭衍生物。此外，东莨菪亭因其具备杀虫、抗菌、杀螨等功效在农业生产中也有广泛应用。在烟草行业，烟叶中东莨菪亭含量是衡量卷烟品质的重要指标。东莨菪亭也可作为香原料用于高品质卷烟生产，提升卷烟的风味与品质。可见，东莨菪亭在医药领域前景广阔，在农业生产和烟草行业中也发挥着重要作用。
2、当前东莨菪亭主要通过化学合成和天然植物提取两种方法生产，化学合成法常受限于低产率、高成本以及大量有害溶剂使用；植物提取法依赖于特定药用植物如丁公藤等，生长周期长，生物体系复杂且成分多样，给提取带来诸多不便，致使提取工艺繁琐、成本高，同时易造成原料损耗与资源浪费。
3、微生物合成技术以其周期短、成本低、绿色环保的显著优势，逐步成为获取高附加值稀有天然产物的重要途径。现有东莨菪亭微生物合成多以阿魏
4、但合成东莨菪亭存在代谢途径冗长、外源基因表达水平低和代谢流调控困难等问题，难以满足东莨菪亭高效生产需求。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的是提供一种用于东莨菪亭合成的菌株共培养体系及其应用，不仅能实现上下游模块独立优化，减少长合成途径代谢负担，还能根据外源基因选择合适宿主细胞，最终实现东莨菪亭从头高效合成，为东莨菪亭的绿色与规模化生产提供技术支持。
2、本专利技术通过以下技术手段解决上述技术问题：
3、用于东莨菪亭合成的菌株共培养体系，该体系包括咖啡酸高产重组菌株和东莨菪亭合成重组菌株，将咖啡酸高产重组菌株和东莨菪亭合成重组菌株分别培养后，再混合共培养而成。
4、作为优选的，所述咖啡酸高产重组菌株和东莨菪亭合成重组菌株的添加比例为1:1-10。
5、进一步优选的，所述共培养体系的发酵培养基为m9液体培养基、m9y液体培养基中的一种。
6、作为优选的，所述共培养体系的培养条件为：于28-37℃、200-300rpm条件下发酵36-72h，发酵时添加iptg诱导剂，并加入葡萄糖作为初始原料。
7、作为优选的，所述咖啡酸高产重组菌株在发酵培养时，包括以下步骤：
8、s1.将咖啡酸高产重组菌株单菌落接种于lb液体培养基中，进行过夜培养，直到菌液的光密度od600达到1.0；
9、s2.按1:100的比例将菌液接种到新lb液体培养基中，继续培养3-5h之后，离心收集菌体，并使用m9液体培养基重新悬浮菌体沉淀，使重悬后菌体od600达到1.0；
10、作为优选的，所述咖啡酸高产重组菌株为:bl21 star(de3)-pacyc::glnsm-fjtal-j23101*-echpabc或/和bl21 star(de3)-pacyc::glnsm-fjtal-j23101*-echpabc-j23101*-echpabc。
11、作为优选的，所述东莨菪亭合成重组菌株在发酵培养时，包括以下步骤：
12、s3.挑取东莨菪亭合成重组菌株单菌落接种于lb液体培养基中，过夜培养至菌液od600至1.0；
13、s4.按1:100比例接种到lb液体培养基中继续培养3-5h后，离心收集菌体，并使用m9液体培养基重新悬浮菌体沉淀，使重悬后菌体od600达到1.0；
14、作为优选的，所述东莨菪亭合成的菌株共培养发酵培养时，包括以下步骤：
15、将s2重悬后的咖啡酸高产重组菌株菌液与s4重悬后的东莨菪亭合成重组菌株菌液按比例接种到至m9液体培养基中，并使菌液od600终浓度值为0.1；然后加入iptg诱导剂和葡萄糖，在28-37℃、200-300rpm的条件下发酵培养36-72h。
16、作为优选的，所述东莨菪亭合成重组菌株在合成时，包括以下步骤：
17、s5.以含atf6′h2合成基因的质粒为模板，利用atf6′h2-ecori-f和atf6′h2-aflii-r引物对，扩增出目标片段atf6′h2；
18、s6.将经过s5步骤处理的atf6′h2通过ecori和aflii双酶切处理，并连接至pgex6p-1质粒经ecori和aflii双酶切处理的对应位置上，构建出中间载体pgex 6p-1::atf6′h2；
19、s7.利用rbs-os4cl-aflii-f和os4cl-xhoi-r引物对含os4cl合成基因质粒模板进行pcr扩增，扩增出目标片段os4cl；
20、s8.将经过s7步骤处理的os4cl进行aflii和xhoi双酶切处理，再连接在中间载体pgex 6p-1::atf6′h2经xhoi和aflii双酶切处理的对应位置上，构建得到pgex 6p-1::atf6′h2-rbs-os4cl；
21、s9.以含atcomt合成基因的质粒为模板，利用atcomt-hm-xhoi-f/r引物对pcr扩增rbs-atcomt，得到目标片段rbs-atcomt；
22、s10.将经过s9步骤处理的rbs-atcomt连接至已由xhoi酶切线性化的pgex 6p-1::atf6′h2-rbs-os4cl质粒的对应位置中，得到重组质粒pgex 6p-1::atf6′h2-rbs-os4cl-rbs-atcomt。
23、s11.将重组质粒pgex 6p-1::atf6′h2-rbs-os4cl-rbs-atcomt转入感受态细胞中，获得东莨菪亭合成重组菌株。
24、作为优选的，所述s11步骤中，感受态细胞为大肠杆菌。
25、本申请还公开了一种用于东莨菪亭合成的菌株共培养体系的应用，应用于东莨菪亭的合成。
26、采用上述方案的本申请，具有如下有益效果：
27、1.本申请中，利用合成生物学代谢工程，选取异源蛋白表达优异的大肠杆菌bl21star(de3)作为底盘细胞，通过咖啡酸高产菌株和东莨菪亭合成本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.用于东莨菪亭合成的菌株共培养体系，其特征在于，该体系包括咖啡酸高产重组菌株和东莨菪亭合成重组菌株，将咖啡酸高产重组菌株和东莨菪亭合成重组菌株分别培养后，再混合共培养而成。
2.根据权利要求1所述的菌株共培养体系，其特征在于，所述咖啡酸高产重组菌株和东莨菪亭合成重组菌株的添加比例为1:1-10。
3.根据权利要求1所述的菌株共培养体系，其特征在于，所述共培养体系的培养条件为：于28-37℃、200-300rpm条件下发酵36-72h，发酵时添加IPTG诱导剂，并加入葡萄糖作为初始原料。
4.根据权利要求1所述的菌株共培养体系，其特征在于，所述咖啡酸高产重组菌株在发酵培养时，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的菌株共培养体系，其特征在于，所述咖啡酸高产重组菌株为:BL21 Star(DE3)-pACYC::glnSm-FjTAL-J23101*-EchpaBC或/和BL21Star(DE3)-pACYC::glnSm-FjTAL-J23101*-EchpaBC-J23101*-EchpaBC。
6.根据权利要求4或5
7.根据权利要求6所述的菌株共培养体系，其特征在于，所述东莨菪亭合成的菌株共培养发酵培养时，包括以下步骤：
8.根据权利要求1所述的菌株共培养体系，其特征在于，所述东莨菪亭合成重组菌株在合成时，包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述的菌株共培养体系，其特征在于，所述S11步骤中，感受态细胞为大肠杆菌。
10.一种如权利要求1-9任一项所述的用于东莨菪亭合成的菌株共培养体系的应用，其特征在于，应用于东莨菪亭的合成、生产。
...【技术特征摘要】
1.用于东莨菪亭合成的菌株共培养体系，其特征在于，该体系包括咖啡酸高产重组菌株和东莨菪亭合成重组菌株，将咖啡酸高产重组菌株和东莨菪亭合成重组菌株分别培养后，再混合共培养而成。
2.根据权利要求1所述的菌株共培养体系，其特征在于，所述咖啡酸高产重组菌株和东莨菪亭合成重组菌株的添加比例为1:1-10。
3.根据权利要求1所述的菌株共培养体系，其特征在于，所述共培养体系的培养条件为：于28-37℃、200-300rpm条件下发酵36-72h，发酵时添加iptg诱导剂，并加入葡萄糖作为初始原料。
4.根据权利要求1所述的菌株共培养体系，其特征在于，所述咖啡酸高产重组菌株在发酵培养时，包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的菌株共培养体系，其特征在于，所述咖啡酸高产重组菌株为:bl21 star(de3)-pacyc::glns...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘蓉，吕祥敏，唐杰，黎洪利，许嘉东，杜红毅，
申请(专利权)人：重庆中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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