【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本披露涉及用于增加切除、倒位和位点特异性整合的方法。本文呈现的方法适用于非同源末端连接(nhej)机制和同源依赖性修复(hdr)机制两者。序列表本申请附有命名为82439-st26.xml的序列表，大小为约252千字节。本序列表通过援引以其全文并入本文。
技术介绍
1、定点核酸酶(sdn)(例如锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶、crispr相关核酸酶)在基因编辑空间中变得越来越流行。这些sdn充当核酸内切酶并且通常在特异性dna序列中产生双链断裂(dsb)，从而激活细胞的内在修复机制(例如，同源重组)。在修复过程期间，可以实现对所述特异性dna序列的定点修饰。crispr(成簇规律间隔短回文重复序列)/cas(crispr相关)系统在细菌和古细菌中演化为适应性免疫系统以防御病毒攻击。最近几年中，crispr/cas系统作为用于基因组编辑的工具吸引了特别关注。产生位点特异性双链断裂(dsb)的crispr/cas系统可用于例如通过在核苷酸序列中产生缺失、插入和/或变化来编辑真核细胞中的dna。
2、由sdn诱导的定点修饰常常缺乏精确性(例如，可能发生脱靶编辑)，并且它们常常以低频率发生。例如，在crispr/cas系统被配置成用于通过产生一个或多个dsb来引起缺失的情况下，缺失的大小可能变化，并且所希望缺失事件的频率可能相对较低。如此，需要用于增加使用sdn进行靶向基因组编辑的效率的方法。
技术实现思路
1、提供本
技术实现思路
是为了介绍下面在具体实施方式中进一步描述
2、在一方面，本文提供了融合蛋白，这些融合蛋白包含与非特异性末端加工酶连接的定点核酸酶。在一些实施例中，该定点核酸酶包括crispr相关核酸酶。在一些实施例中，crispr相关核酸酶选自由以下组成的组：cas5、cas6、cas7、cas8、cas9、cas12a、cas12b、cas12i、cas12j、cas12l、cas12e、cas12c、cas12d、cas12g、cas12h、tnpb、cas13a、cas13b、cas14及其切口酶或失活形式。在一些实施例中，该crispr相关核酸酶是cas9酶。在一些实施例中，该crispr相关核酸酶是cas12a酶。
3、在本文提供的融合蛋白一些实施例中，该非特异性末端加工酶是非特异性核酸外切酶。在一些实施例中，该非特异性核酸外切酶是t5exo、trex2、大肠杆菌核酸外切酶i、核酸外切酶iii、核酸外切酶t、核酸外切酶ix、核酸外切酶x、recj、pol ii、pol iiiε、wrn、mre11、ape1、vdjp、rad1、rad9、p53或trex1。在一些实施例中，该非特异性末端加工酶包含与seq id no:4、5、18、19、20、22或58-74中的任一个具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，该非特异性末端加工酶是二聚化的蛋白质的单体。
4、在本文提供的融合蛋白的一些实施例中，该融合蛋白包含位于该定点核酸酶与该非特异性末端加工酶之间的接头。在一些实施例中，该接头包含seq id no:7。在一些实施例中，该融合蛋白包含核定位信号。在一些实施例中，该融合蛋白包含与seq id no:50-57中的任一个具有至少90％同一性的氨基酸序列。
5、本文还提供了重组核酸，这些重组核酸编码本文所述的任一种融合蛋白。还提供了dna构建体，该dna构建体包含与本文所述的重组核酸可操作地连接的启动子。在一些实施例中，该启动子是诱导型启动子、组成型启动子、卵细胞特异性启动子、花粉特异性启动子或顶端分生组织特异性启动子中的至少一种。在一些实施例中，该启动子是泛素4启动子、肌动蛋白启动子、微管蛋白启动子、mads盒启动子或植物病毒启动子。本文还提供了载体，这些载体包含本文所述的重组核酸或dna构建体。本文还提供了细胞，这些细胞包含本文所述的重组核酸、dna构建体或载体。在一些实施例中，这些细胞是植物细胞。在一些实施例中，这些植物细胞是玉米植物细胞、大豆植物细胞、稻植物细胞、小麦植物细胞和/或向日葵植物细胞。
6、本文还提供了编辑核酸的方法，这些方法包括提供本文所述的至少一种融合蛋白；提供该核酸，其中该核酸包含第一结合位点、第二结合位点和含有该核酸的一部分的靶区，其中该第一结合位点与该靶区的5’端相邻并且该第二结合位点与该靶区的3’端相邻；并且使该核酸与该至少一种融合蛋白接触，其中该至少一种融合蛋白特异性结合该第一结合位点和该第二结合位点，从而导致对该核酸的该靶区的编辑。在一些实施例中，该至少一种融合蛋白的定点核酸酶包括crispr相关核酸酶，并且该方法进一步包括提供至少一个第一指导rna和至少一个第二指导rna，其中该至少一个第一指导rna包含与该第一结合位点具有互补性的核苷酸序列并且该至少一个第二指导rna包含与该第二结合位点具有互补性的核苷酸序列。在一些实施例中，该第一结合位点和该第二结合位点在相同链上。在一些实施例中，该第一结合位点和该第二结合位点在相反链上。在一些实施例中，该第一结合位点或该第二结合位点中的至少一者在该靶区内。在一些实施例中，该第一结合位点和该第二结合位点两者均在该靶区内。在一些实施例中，该第一结合位点和该第二结合位点都不在该第一靶区内。
7、在本文提供的编辑核酸的方法的一些实施例中，这些方法进一步包括提供供体核酸，其中该供体核酸包含第三结合位点、第四结合位点和供体核苷酸区，其中该第三结合位点与该供体核苷酸区的5’端相邻并且该第四结合位点与该供体核苷酸区的3’端相邻，并且其中该至少一种融合蛋白特异性结合该第三结合位点和该第四结合位点。在一些实施例中，该至少一种融合蛋白的定点核酸酶包括crispr相关核酸酶，并且该方法进一步包括提供至少一个第三指导rna和至少一个第四指导rna，其中该至少一个第三指导rna包含与该第三结合位点具有互补性的核苷酸序列并且该至少一个第四指导rna包含与该第四结合位点具有互补性的核苷酸序列。在一些实施例中，该第三结合位点和该第四结合位点在相同链上。在一些实施例中，该第三结合位点和该第四结合位点在相反链上。在一些实施例中，该第三结合位点或该第四结合位点中的至少一者在该供体核苷酸区内。在一些实施例中，该第三结合位点和该第四结合位点两者均在该供体核苷酸区内。在一些实施例中，该第三结合位点和该第四结合位点都不在该供体核苷酸区内。
8、在本文提供的编辑核酸的方法的一些实施例中，该核酸是第一染色体的一部分。在一些实施例中，该供体核酸是供体模板的一部分。在一些实施例中，该供体模板是质粒或线性核酸的一部分。
9、在本文提供的编辑核酸的方法的一些实施例中，该编辑是对该靶区的至少一部分的切除、倒位或置换。
10、在本文提供的编辑核酸的方法的一些实施例中，该供体核酸是第二染色体的一部分。在一些实施例中，该第一染色体和该第二染色体是同源染色本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含与非特异性末端加工酶连接的定点核酸酶。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述定点核酸酶包括CRISPR相关核酸酶。
3.如权利要求2所述的融合蛋白，其中所述CRISPR相关核酸酶选自由以下组成的组：Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas12a、Cas12b、Cas12i、Cas12j、Cas12L、Cas12e、Cas12c、Cas12d、Cas12g、Cas12h、TnpB、Cas13a、Cas13b、Cas14及其切口酶或失活形式。
4.如权利要求3所述的融合蛋白，其中所述CRISPR相关核酸酶是Cas9酶。
5.如权利要求3所述的融合蛋白，其中所述CRISPR相关核酸酶是Cas12a酶。
6.如权利要求1至5中任一项所述的融合蛋白，其中所述非特异性末端加工酶是非特异性核酸外切酶。
7.如权利要求6所述的融合蛋白，其中所述非特异性核酸外切酶是T5Exo、Trex2、大肠杆菌核酸外切酶I、核酸外切酶III、核酸外切酶T、核酸外切酶IX、核酸外切酶X、R
8.如权利要求1至7中任一项所述的融合蛋白，其中所述非特异性末端加工酶包含与SEQ ID NO:4、5、18、19、20、22或58-74中的任一个具有至少90％同一性的氨基酸序列。
9.如权利要求1至8中任一项所述的融合蛋白，其中所述非特异性末端加工酶是二聚化的蛋白质的单体。
10.如权利要求1至9中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含位于所述定点核酸酶与所述非特异性末端加工酶之间的接头。
11.如权利要求10所述的融合蛋白，其中所述接头包含SEQ ID NO:7。
12.如权利要求1至11中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含核定位信号。
13.如权利要求1至12中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含与SEQ ID NO:50-57中的任一个具有至少90％同一性的氨基酸序列。
14.一种重组核酸，所述重组核酸编码如权利要求1至13中任一项所述的融合蛋白。
15.一种DNA构建体，所述DNA构建体包含与如权利要求14所述的重组核酸可操作地连接的启动子。
16.如权利要求15所述的DNA构建体，其中该启动子是诱导型启动子、组成型启动子、卵细胞特异性启动子、花粉特异性启动子或顶端分生组织特异性启动子中的至少一种。
17.如权利要求15或16所述的DNA构建体，其中所述启动子是泛素4启动子、肌动蛋白启动子、微管蛋白启动子、MADS盒启动子或植物病毒启动子。
18.一种载体，所述载体包含如权利要求14所述的重组核酸或如权利要求15至17中任一项所述的DNA构建体。
19.一种细胞，所述细胞包含如权利要求14所述的重组核酸、如权利要求15至17中任一项所述的DNA构建体或如权利要求18所述的载体。
20.如权利要求19所述的细胞，其中所述细胞是植物细胞。
21.如权利要求20所述的细胞，其中所述植物细胞是玉米植物细胞、大豆植物细胞、稻植物细胞、小麦植物细胞或向日葵植物细胞。
22.一种编辑核酸的方法，所述方法包括：
23.如权利要求22所述的方法，其中所述至少一种融合蛋白的定点核酸酶包括CRISPR相关核酸酶，并且所述方法进一步包括提供至少一个第一指导RNA和至少一个第二指导RNA，其中所述至少一个第一指导RNA包含与所述第一结合位点具有互补性的核苷酸序列并且所述至少一个第二指导RNA包含与所述第二结合位点具有互补性的核苷酸序列。
24.如权利要求22或23所述的方法，其中所述第一结合位点和所述第二结合位点在相同链上。
25.如权利要求22或23所述的方法，其中所述第一结合位点和所述第二结合位点在相反链上。
26.如权利要求22至25中任一项所述的方法，其中所述第一结合位点或所述第二结合位点中的至少一者在所述靶区内。
27.如权利要求22至26中任一项所述的方法，其中所述第一结合位点和所述第二结合位点两者均在所述靶区内。
28.如权利要求22至25中任一项所述的方法，其中所述第一结合位点和所述第二结合位点都不在第一靶区内。
29.如权利要求22至28中任一项所述的方法，所述方法进一步包括提供供体核酸，其中所述供体核酸包含第三结合位点、第四结合位点和供体核苷酸区，...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含与非特异性末端加工酶连接的定点核酸酶。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其中所述定点核酸酶包括crispr相关核酸酶。
3.如权利要求2所述的融合蛋白，其中所述crispr相关核酸酶选自由以下组成的组：cas5、cas6、cas7、cas8、cas9、cas12a、cas12b、cas12i、cas12j、cas12l、cas12e、cas12c、cas12d、cas12g、cas12h、tnpb、cas13a、cas13b、cas14及其切口酶或失活形式。
4.如权利要求3所述的融合蛋白，其中所述crispr相关核酸酶是cas9酶。
5.如权利要求3所述的融合蛋白，其中所述crispr相关核酸酶是cas12a酶。
6.如权利要求1至5中任一项所述的融合蛋白，其中所述非特异性末端加工酶是非特异性核酸外切酶。
7.如权利要求6所述的融合蛋白，其中所述非特异性核酸外切酶是t5exo、trex2、大肠杆菌核酸外切酶i、核酸外切酶iii、核酸外切酶t、核酸外切酶ix、核酸外切酶x、recj、polii、poliiiε、wrn、mre11、ape1、vdjp、rad1、rad9、p53或trex1。
8.如权利要求1至7中任一项所述的融合蛋白，其中所述非特异性末端加工酶包含与seq id no:4、5、18、19、20、22或58-74中的任一个具有至少90％同一性的氨基酸序列。
9.如权利要求1至8中任一项所述的融合蛋白，其中所述非特异性末端加工酶是二聚化的蛋白质的单体。
10.如权利要求1至9中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含位于所述定点核酸酶与所述非特异性末端加工酶之间的接头。
11.如权利要求10所述的融合蛋白，其中所述接头包含seq id no:7。
12.如权利要求1至11中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含核定位信号。
13.如权利要求1至12中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含与seq id no:50-57中的任一个具有至少90％同一性的氨基酸序列。
14.一种重组核酸，所述重组核酸编码如权利要求1至13中任一项所述的融合蛋白。
15.一种dna构建体，所述dna构建体包含与如权利要求14所述的重组核酸可操作地连接的启动子。
16.如权利要求15所述的dna构建体，其中该启动子是诱导型启动子、组成型启动子、卵细胞特异性启动子、花粉特异性启动子或顶端分生组织特异性启动子中的至少一种。
17.如权利要求15或16所述的dna构建体，其中所述启动子是泛素4启动子、肌动蛋白启动子、微管蛋白启动子、mads盒启动子或植物病毒启动子。
18.一种载体，所述载体包含如权利要求14所述的重组核酸或如权利要求15至17中任一项所述的dna构建体。
19.一种细胞，所述细胞包含如权利要求14所述的重组核酸、如权利要求15至17中任一项所述的dna构建体或如权利要求18所述的载体。
20.如权利要求19所述的细胞，其中所述细胞是植物细胞。
21.如权利要求20所述的细胞，其中所述植物细胞是玉米植物细胞、大豆植物细胞、稻植物细胞、小麦植物细胞或向日葵植物细胞。
22.一种编辑核酸的方法，所述方...
【专利技术属性】
技术研发人员：许建平，施皖，
申请(专利权)人：先正达农作物保护股份公司，
类型：发明
国别省市：
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