【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学检测，具体涉及一种基于exo iii磷酸酶活性建立的新型核酸检测方法。
技术介绍
1、核酸传感技术的发展在医疗诊断、食品安全以及环境保护等领域具有重要意义。exo iii是一种常见的细菌核酸外切酶，具有易获得、催化活性高以及对底物序列和长度偏好性低的特点。
2、据统计，自2010年后，有大量文献报道利用exo iii开发了针对核酸以及非核酸靶标的检测方法。这些方法均利用exo iii的核酸外切酶活性，通常地，其对dsdna的切割活性是ssdna的5-10倍。一般地，基于exo iii检测核酸的过程如下：1）发卡探针模板识别并与靶标核酸杂交形成部分dsdna的结构；2）exo iii识别并降解该dsdna部分释放荧光信号，同时靶标核酸被释放，并参与下一轮与探针模板杂交和exo iii切割过程。上述检测方法通过靶标的循环放大在一定程度上实现了靶标信号放大的目的。但是，该检测方法存在exo iii对ssdna模板和荧光探针的非特异性切割，具有较低的扩增效率以及假阳性信号的产生等问题。
3、因此，有必要提供一种基于exo iii磷酸酶活性建立的新型核酸检测方法，以解决现有技术中所存在的不足。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种基于exo iii磷酸酶活性建立的新型核酸检测方法。用于解决现有的检测方法存在exo iii对ssdna模板和荧光探针的非特异性切割，具有较低的扩增效率以及假阳性信号的产生等问题。
2、在第一方面，
3、本专利技术中，利用exo iii蛋白的磷酸酶活性切割荧光探针，从而释放出淬灭基团，导致荧光探针上的荧光基团的荧光信号增加，当待测样品中的目标序列与荧光探针互补结合后，exo iii蛋白的磷酸酶活性受到抑制，导致荧光探针上的荧光基团的荧光信号减弱；根据荧光信号的相对强度，从而对待测样品中的目标序列进行定量检测；本专利技术提供的检测方法具有操作简单、反应快速、灵敏度高、特异性好的优势。
4、在一些实施方案中，缓冲液包括hepes缓冲液，并且hepes缓冲液中含有mn2+离子；其中，mn2+离子的浓度为0.05-1mm，例如可以为0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm、1mm或该范围内的其他数值。
5、可以理解地是，本专利技术中，缓冲液可以根据实际使用需要进行常规选择，本专利技术中，缓冲液优选包括hepes缓冲液。
6、在一些实施方案中，缓冲液的ph值为7.5-8.2，例如可以为7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2或该范围内的其他数值。
7、在一些实施方案中，exo iii蛋白的浓度为0.01-1nm，例如可以为0.01nm、0.03nm、0.05nm、0.07nm、0.09nm、1nm或该范围内的其他数值。
8、可以理解地是，本专利技术中，exo iii蛋白可以通过市售途径获得，也可以使用基因工程菌进行表达，经纯化后获得。
9、在一些实施方案中，淬灭基团修饰于荧光探针的3’端；荧光基团修饰于靠近荧光探针3’端的t碱基上。
10、本专利技术中，专利技术人进一步研究发现，利用exo iii蛋白的3’磷酸酶活性切割荧光探针，从而释放出荧光探针3’端的淬灭基团，导致荧光探针上的荧光基团的荧光信号增加，当待测样品中的目标序列与荧光探针互补结合后，exo iii蛋白的磷酸酶活性受到抑制，导致荧光探针上的荧光基团的荧光信号减弱；根据荧光信号的相对强度，从而对待测样品中的目标序列进行定量检测。
11、在一些实施方案中，荧光基团包括fam、cy5、vic、rox中的至少一种；淬灭基团包括bhq1。
12、可以理解地是，本专利技术中，荧光基团和淬灭基团可以根据实际使用需要进行常规选择，本专利技术中，荧光基团优选包括fam、cy5、vic、rox中的至少一种；淬灭基团优选包括bhq1。
13、在一些实施方案中，混匀后进行反应具体包括：在温度为20-40℃（例如可以为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃或该范围内的其他数值）的条件下，反应6-10min，例如可以为6min、7min、8min、9min、10min或该范围内的其他数值。
14、在一些实施方案中，还包括绘制标准曲线的步骤，步骤包括：将不同浓度梯度的阳性标准品分别添加至检测体系中，混匀后进行反应，并检测可检测信号，根据不同浓度梯度的阳性标准品对应的可检测信号数值绘制得到标准曲线；其中，阳性标准品包括目标序列。
15、在一些实施方案中，目标序列包括dna序列、rna序列中的至少一种。
16、在一些实施方案中，可检测信号包括荧光信号。
17、本专利技术的有益效果是：区别于现有技术的情况，本专利技术通过利用exo iii蛋白的磷酸酶活性切割荧光探针，从而释放出淬灭基团，导致荧光探针上的荧光基团的荧光信号增加，当待测样品中的目标序列与荧光探针互补结合后，exo iii蛋白的磷酸酶活性受到抑制，导致荧光探针上的荧光基团的荧光信号减弱；根据荧光信号的相对强度，从而对待测样品中的目标序列进行定量检测；本专利技术提供的检测方法具有操作简单、反应快速、灵敏度高、特异性好的优势；同时，该检测方法中所需的检测试剂容易获得、价格低廉、易于储存和运输，并且操作简单，不需要特殊仪器，实现了一步法检测，可以满足家庭日常使用以及医院中核酸类以及非核酸类样本的高通量检测的需求。
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1. 一种基于Exo III磷酸酶活性建立的新型核酸检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
2. 根据权利要求1所述的基于Exo III磷酸酶活性建立的新型核酸检测方法，其特征在于，所述缓冲液包括HEPES缓冲液，并且所述HEPES缓冲液中含有Mn2+离子；
3. 根据权利要求1所述的基于Exo III磷酸酶活性建立的新型核酸检测方法，其特征在于，所述缓冲液的pH值为7.5-8.2。
4. 根据权利要求1所述的基于Exo III磷酸酶活性建立的新型核酸检测方法，其特征在于，所述Exo III蛋白的浓度为0.01-1nM。
5. 根据权利要求1所述的基于Exo III磷酸酶活性建立的新型核酸检测方法，其特征在于，所述淬灭基团修饰于所述荧光探针的3’端；所述荧光基团修饰于靠近所述荧光探针3’端的T碱基上。
6. 根据权利要求5所述的基于Exo III磷酸酶活性建立的新型核酸检测方法，其特征在于，所述荧光基团包括FAM、CY5、VIC、ROX中的至少一种；所述淬灭基团包括BHQ1。
7. 根据权利要求1所述的基于Ex
8. 根据权利要求1所述的基于Exo III磷酸酶活性建立的新型核酸检测方法，其特征在于，还包括绘制标准曲线的步骤，所述步骤包括：将不同浓度梯度的阳性标准品分别添加至所述检测体系中，混匀后进行反应，并检测所述可检测信号，根据所述不同浓度梯度的阳性标准品对应的可检测信号数值绘制得到所述标准曲线；
9. 根据权利要求1所述的基于Exo III磷酸酶活性建立的新型核酸检测方法，其特征在于，所述目标序列包括DNA序列、RNA序列中的至少一种。
10. 根据权利要求1所述的基于Exo III磷酸酶活性建立的新型核酸检测方法，其特征在于，所述可检测信号包括荧光信号。
...【技术特征摘要】
1. 一种基于exo iii磷酸酶活性建立的新型核酸检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
2. 根据权利要求1所述的基于exo iii磷酸酶活性建立的新型核酸检测方法，其特征在于，所述缓冲液包括hepes缓冲液，并且所述hepes缓冲液中含有mn2+离子；
3. 根据权利要求1所述的基于exo iii磷酸酶活性建立的新型核酸检测方法，其特征在于，所述缓冲液的ph值为7.5-8.2。
4. 根据权利要求1所述的基于exo iii磷酸酶活性建立的新型核酸检测方法，其特征在于，所述exo iii蛋白的浓度为0.01-1nm。
5. 根据权利要求1所述的基于exo iii磷酸酶活性建立的新型核酸检测方法，其特征在于，所述淬灭基团修饰于所述荧光探针的3’端；所述荧光基团修饰于靠近所述荧光探针3’端的t碱基上。
6. 根据权利要求5所述的基于exo iii磷酸酶活性建立的新型核酸检测方法，其特征在于，所述...
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