【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及酶工程，具体涉及一种l-天冬氨酸转氨酶突变体及其应用。
技术介绍
1、非天然氨基酸中手性化合物在日常生活中占据十分重要的角色，尤其在药品的生产中，其作为药物中间体发挥着巨大的作用。非天然氨基酸的获得方式通常与常见天然氨基酸不同，常见天然氨基酸又称蛋白质氨基酸可以通过生物合成直接获取。而非天然氨基酸不存在于天然多肽链中，它们通常是植物、真菌等的次级代谢产物，通常通过天然氨基酸或相关化合物通过化学修饰的方式来获得。根据文献报道，目前已有超过800种非天然氨基酸被发现，它们具有可转化的官能团，通常被用于现代新型药物或新型材料的生产中。研究发现，它们虽含量极少，但效果不可替代，如作为药物前体、生物光谱学、药物探针修饰等在生物体发挥重要调节作用。在非天然氨基酸中，具有d型和l型两种对映体构型。在其构型为l型的氨基酸中，l-苯甘氨酸作为一种l型的非天然氨基酸有着广泛的应用，其衍生物l-对羟基苯甘氨酸、l-邻氯苯甘氨酸等在药物中间体的合成中也起着关键作用。
2、l-苯甘氨酸可用作手性有机合成中间体和医药化学合成原料，例如l-苯甘氨酸可用于药物分子氨苄青霉素和头孢氨苄的合成，氨苄青霉素是一种β-内酰胺类抗生素，可治疗多种细菌感染。头孢氨苄是一种半合成的代口服头孢霉素类抗生素药物，能抑制细胞壁的合成，使细胞内容物膨胀至破裂溶解，杀死细菌。适用于敏感菌所致的急性扁桃体炎、中耳炎等呼吸道感染、尿路感染及皮肤软组织感染等。
3、l-邻氯苯甘氨酸作为l-苯甘氨酸衍生物，其主要应用于抗血栓类药物、抗菌类药物和抗肿瘤类药
4、l-对羟基苯甘氨酸是l-苯甘氨酸的另一种衍生物，具有良好的配位性能，容易获取且无毒无害，可作为合成手性配合物的理想配体。l-对羟基苯甘氨酸存在于多种多肽天然产物中，包括糖肽、抗生素和具有生物活性的线性肽和环状肽，通常被用作万古霉素生物合成的重要组成部分。
5、目前，常见的l-苯甘氨酸及其衍生物的制备的方法主要分为化学合成法和生物合成法，其中化学合成法有非对映体盐拆分法、诱导结晶法和不对称转化法。化学合成法的合成工艺较为复杂，步骤繁多、需要使用有机试剂进行保护和脱保护过程、对环境不友好、异构体分离困难以及产物收率低。相较于化学合成，利用生物法合成l-苯甘氨酸及其衍生物的优点包括以下几点：(1)反应一步进行，副反应少，分离纯化较为简单；(2)绿色合成，原子利用率高，经济性强；(3)产物提纯后的废水处理简单，有利于大规模应用。因此，对l-邻氯苯甘氨酸的生物合成法进行深入研究，以提高合成效率，节约生产成本，对生物合成l-苯甘氨酸衍生物的工业化发展具有重要意义。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种l-天冬氨酸转氨酶突变体及其应用，将突变体用于制备l-苯甘氨酸衍生物，对于不同的衍生物中，发现对于l-邻氯苯甘氨酸转化率显著提升，最高可达93.2％。
2、在本专利技术的一个方面，本专利技术提出了一种l-天冬氨酸转氨酶突变体。根据本专利技术的实施例，所述l-天冬氨酸转氨酶突变体是将l-天冬氨酸转氨酶的氨基酸序列的第104位氨基酸进行单突变获得的。
3、另外，根据本专利技术上述实施例的一种l-天冬氨酸转氨酶突变体，还可以具有如下附加的技术特征：
4、在本专利技术的一些实施例中，所述l-天冬氨酸转氨酶突变体的突变形式为第104位苏氨酸突变为丝氨酸，所述l-天冬氨酸转氨酶突变体的氨基酸序列如序列表seq id no.3所示。
5、在本专利技术的另一方面，本专利技术提出了一种含所述的l-天冬氨酸转氨酶突变体编码基因的表达载体，所述表达载体为pet-28a(+)。
6、在本专利技术的另一方面，本专利技术提出了一种含所述表达载体的重组l-天冬氨酸转氨酶大肠杆菌。具体的，将突变体编码基因导入表达载体后得到的重组表达质粒转入大肠杆菌细胞，得到所述重组l-天冬氨酸转氨酶大肠杆菌。
7、在本专利技术的另一方面，本专利技术提出了所述l-天冬氨酸转氨酶突变体在催化生成l-苯甘氨酸衍生物中的应用。
8、在本专利技术的另一方面，本专利技术提出了一种l-苯甘氨酸衍生物的合成方法，根据本专利技术的实施例，所述方法包括以下步骤：
9、(1)将l-天冬氨酸转氨酶的氨基酸序列的第104位氨基酸进行点突变，获得诱导表达重组l-天冬氨酸转氨酶突变体的基因工程菌；
10、(2)将步骤(1)得到的基因工程菌扩大培养后，离心收集菌体，清洗一次之后重悬，即获得细胞悬浮液；将细胞悬浮液置于冰浴中超声破碎后再离心，所得上清液即为重组l-天冬氨酸转氨酶突变体酶；
11、(3)在反应溶液中依次加入底物、辅酶和步骤(2)得到的重组l-天冬氨酸转氨酶突变酶组成反应体系，反应结束后，将反应液离心过膜，即得所述l-苯甘氨酸衍生物。
12、另外，根据本专利技术上述实施例的一种l-苯甘氨酸衍生物的合成方法，还可以具有如下附加的技术特征：
13、在本专利技术的一些实施例中，步骤(2)中，所述超声破碎的功率为170-180w，超声开1-2s，超声关2-3s，时间为25-30min。
14、在本专利技术的一些实施例中，步骤(3)中，所述底物为邻氯苯氧乙酸及l-谷氨酸钠；所述反应溶液为ph值为8.0-8.5的98-102mmol/l的tris-hcl缓冲液；所述辅酶为磷酸吡哆醛。
15、在本专利技术的一些实施例中，所述邻氯苯氧乙酸及l-谷氨酸钠的终浓度分别为19.5-20.5mmol/l及40-45mmol/l，辅酶的终浓度为3-5mmol/l。
16、在本专利技术的一些实施例中，步骤(3)中，所述反应的温度为34.5-35.5℃，所述反应的时间为20-24h。
17、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
18、本专利技术对现有l-天冬氨酸转氨酶进行定点突变，极大限度地提高天然酶的催化性能，在对特定的底物下，得到的突变体酶活提升至原始酶的3倍左右。在优化体系下，以重组菌的粗酶液为催化剂，在催化生成l-苯甘氨酸衍生物的反应中，效果得到明显提升，l-邻氯苯甘氨酸作为l-苯甘氨酸的衍生物之一，在突变体酶的催化作用下，以邻氯苯氧乙酸和l-谷氨酸钠盐为底物，结合辅酶plp的作用，在转化邻氯苯氧乙酸至l-邻氯苯甘氨酸时转化率显著提高，具备大规模应用的潜力，在l-苯甘氨酸衍生物的工业化生产中具有极高的应用价值。
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1.一种L-天冬氨酸转氨酶突变体，其特征在于，所述L-天冬氨酸转氨酶突变体是将L-天冬氨酸转氨酶的氨基酸序列的第104位氨基酸进行单突变获得的。
2.根据权利要求1所述的一种L-天冬氨酸转氨酶突变体，其特征在于，所述L-天冬氨酸转氨酶突变体的突变形式为第104位苏氨酸突变为丝氨酸，所述L-天冬氨酸转氨酶突变体的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。
3.一种含权利要求1或2所述的L-天冬氨酸转氨酶突变体编码基因的表达载体。
4.一种含权利要求3所述表达载体的重组L-天冬氨酸转氨酶大肠杆菌。
5.权利要求1或2所述L-天冬氨酸转氨酶突变体在催化生成L-苯甘氨酸衍生物中的应用。
6.一种L-苯甘氨酸衍生物的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的一种L-苯甘氨酸衍生物的合成方法，其特征在于：步骤(2)中，所述超声破碎的功率为170-180W，超声开1-2s，超声关2-3s，时间为25-30min。
8.根据权利要求6所述的一种L-苯甘氨酸衍生物的合成方法，其特征在于：步骤
9.根据权利要求8所述的一种L-苯甘氨酸衍生物的合成方法，其特征在于：所述邻氯苯氧乙酸及L-谷氨酸钠的终浓度分别为19.5-20.5mmol/L及40-45mmol/L，辅酶的终浓度为3-5mmol/L。
10.根据权利要求6所述的一种L-苯甘氨酸衍生物的合成方法，其特征在于：步骤(3)中，所述反应的温度为34.5-35.5℃，所述反应的时间为20-24h。
...【技术特征摘要】
1.一种l-天冬氨酸转氨酶突变体，其特征在于，所述l-天冬氨酸转氨酶突变体是将l-天冬氨酸转氨酶的氨基酸序列的第104位氨基酸进行单突变获得的。
2.根据权利要求1所述的一种l-天冬氨酸转氨酶突变体，其特征在于，所述l-天冬氨酸转氨酶突变体的突变形式为第104位苏氨酸突变为丝氨酸，所述l-天冬氨酸转氨酶突变体的氨基酸序列如序列表seq id no.3所示。
3.一种含权利要求1或2所述的l-天冬氨酸转氨酶突变体编码基因的表达载体。
4.一种含权利要求3所述表达载体的重组l-天冬氨酸转氨酶大肠杆菌。
5.权利要求1或2所述l-天冬氨酸转氨酶突变体在催化生成l-苯甘氨酸衍生物中的应用。
6.一种l-苯甘氨酸衍生物的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的一种l-苯甘氨酸衍...
【专利技术属性】
技术研发人员：张洪斌，张鑫，肖钰燕，杨静文，胡雪芹，
申请(专利权)人：合肥工业大学，
类型：发明
国别省市：
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