【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
当前公开的主题涉及采用多载体重组酶介导的盒式交换方法的细胞系开发，以实现用于生成宿主细胞的目标序列的靶向整合，该宿主细胞表达重组蛋白例如单克隆抗体，以及由其衍生的组合物例如双特异性抗体，和其他复杂形式的蛋白质例如膜蛋白复合物，以及其他难以表达的分子。
技术介绍
1、由于细胞生物学和免疫学的快速发展，对开发用于多种疾病(包括癌症、心血管疾病和代谢疾病)的新颖治疗性重组蛋白(例如单克隆抗体、双特异性抗体和复杂形式的蛋白质)的需求日益增加。这些候选生物药物通常通过能够表达目的蛋白质的商业化细胞系进行生产。举例而言，近年来，中国仓鼠卵巢(cho)细胞已广泛适用于生产治疗性单克隆抗体或双特异性抗体以及更复杂形式的蛋白质。
2、用于开发商业细胞系的常规策略通常涉及不断致力于进行将编码目标多肽的核苷酸序列(随机或在特定(“靶向”)位置处)整合，然后选择和分离产生该多肽的细胞系。然而，本领域需要新的细胞系开发策略，该策略不仅节省资源，而且生成的细胞系表现出相对于常规方法改善的表达水平、产物质量属性和生产培养物效能。
技术实现思路
1、当前公开的主题涉及多载体重组酶介导的盒式交换(多载体rmce)方法，以实现用于生成宿主细胞的目标序列的靶向整合，该宿主细胞表达重组蛋白例如单克隆抗体，以及由其衍生的组合物例如双特异性抗体，和其他复杂形式的蛋白质例如膜蛋白复合物，以及其他难以表达的分子。
2、在某些实施例中，本公开涉及包含整合在如下序列内的整合位点处的外源性核苷酸序列的ti宿主细
3、在某些实施例中，本公开涉及制备表达soi的ti宿主细胞的方法，该方法包括：a)提供包含整合在如下序列内的整合位点处的外源性核苷酸序列的ti宿主细胞：(a)与nw_006874047.1的核苷酸41190至45269的全部或部分、nw_006884592.1的核苷酸63590至207911的全部或部分、nw_006881296.1的核苷酸253831至491909的全部或部分、nw_003616412.1的核苷酸69303至79768的全部或部分、nw_003615063.1的核苷酸293481至315265的全部或部分、nw_006882936.1的核苷酸2650443至2662054的全部或部分、或nw_003615411.1的核苷酸82214至97705的全部或部分至少约90％同源；或(b)与nw_006874047.1的核苷酸45270至45490的全部或部分、nw_006884592.1的核苷酸207912至792374的全部或部分、nw_006881296.1的核苷酸491910至667813的全部或部分、nw_003616412.1的核苷酸79769至100059的全部或部分、nw_003615063.1的核苷酸315266至362442的全部或部分、nw_0本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种靶向整合(TI)宿主细胞，其包含整合在如下序列内的整合位点处的外源核苷酸序列：
2.根据权利要求1所述的TI宿主细胞，其中所述RRS选自由以下项组成的组：LoxP序列、LoxP L3序列、LoxP 2L序列、LoxFas序列、Lox5 l l序列、Lox2272序列、Lox2372序列、Lox5l7l序列、Loxm2序列、Lox7l序列、Lox66序列、FRT序列、Bxbl attP序列、Bxbl attB序列、attP序列和attB序列。
3.根据权利要求1所述的TI宿主细胞，其中所述RRS通过选自由以下项组成的组的重组酶来识别：Cre重组酶、FLP重组酶、Bxbl整合酶和整合酶。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的TI宿主细胞，其中所述外源核苷酸序列包含位于最5'的RRS与在3'方向的下一个RRS之间的选择标志物。
5.根据权利要求4所述的TI宿主细胞，其中所述选择标志物选自由以下项组成的组：氨基糖苷磷酸转移酶(APH)、潮霉素磷酸转移酶(HYG)、新霉素、G418(APH)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK
6.根据权利要求5所述的TI宿主细胞，其进一步包含第二选择标志物，其中所述第一选择标志物和所述第二选择标志物是不同的。
7.根据权利要求6所述的TI宿主细胞，其中所述第二选择标志物选自由以下项组成的组：氨基糖苷磷酸转移酶(APH)、潮霉素磷酸转移酶(HYG)、新霉素、G418(APH)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、谷氨酰胺合成酶(GS)、天冬酰胺合成酶、色氨酸合成酶(吲哚)、组氨醇脱氢酶(组氨醇D)、杀稻瘟菌素、博莱霉素、腐草霉素、氯霉素、吉欧霉素和霉酚酸。
8.根据权利要求6所述的TI宿主细胞，其进一步包含第三选择标志物和内部核糖体进入位点(IRES)，其中所述IRES与第三选择标志物可操作地连接。
9.根据权利要求8所述的TI宿主细胞，其中所述第三选择标志物不同于所述第一选择标志物或所述第二选择标志物。
10.根据权利要求9所述的TI宿主细胞，其中所述第三选择标志物选自由以下项组成的组：绿色荧光蛋白(GFP)标志物、增强型GFP(eGFP)标志物、合成GFP标志物、黄色荧光蛋白(YFP)标志物、增强型YFP(eYFP)标志物、蓝绿色荧光蛋白(CFP)标志物、mPlum标志物、mCherry标志物、tdTomato标志物、mStrawberry标志物、J-red标志物、DsRed-单体标志物、mOrange标志物、mKO标志物、mCitrine标志物、Venus标志物、YPet标志物、Emerald6标志物、CyPet标志物、mCFPm标志物、Cerulean标志物和T-Sapphire标志物。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的TI宿主细胞，其中所述TI宿主细胞为哺乳动物宿主细胞。
12.根据权利要求11所述的TI宿主细胞，其中所述TI宿主细胞为仓鼠宿主细胞、人类宿主细胞、大鼠宿主细胞或小鼠宿主细胞。
13.根据权利要求11或12所述的TI宿主细胞，其中所述TI宿主细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)宿主细胞、CHO K1宿主细胞、CHO K1 SV宿主细胞、DG44宿主细胞、DUKXB-1 1宿主细胞、CHOK1 S宿主细胞或CHO K1M宿主细胞。
14.一种制备表达目标序列(SOI)的TI宿主细胞的方法，所述方法包括：
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述重组酶选自Cre重组酶、FLP重组酶、Bxbl整合酶和整合酶。
16.根据权利要求14至15中任一项所述的方法，其中所述SOI编码单链抗体、抗体轻链、抗体重链、单链Fv片段(scFv)或Fc融合蛋白。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的方法，其中所述TI宿主细胞为哺乳动物宿主细胞。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述TI宿主细胞为仓鼠宿主细胞、人类宿主细胞、大鼠宿主细胞或小鼠宿主细胞。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述TI宿主细胞为CHO宿主细胞、CHO K1宿主细胞、CHO K1SV宿主细胞、DG44宿主细胞、DUKXB-1 1宿主细胞、CHOK1S宿主细胞或CHOK1M宿主细胞。
20.根据权利要求14至19中任一项所述的方法，其中所述载体选自由以下项组成的组：腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种靶向整合(ti)宿主细胞，其包含整合在如下序列内的整合位点处的外源核苷酸序列：
2.根据权利要求1所述的ti宿主细胞，其中所述rrs选自由以下项组成的组：loxp序列、loxp l3序列、loxp 2l序列、loxfas序列、lox5 l l序列、lox2272序列、lox2372序列、lox5l7l序列、loxm2序列、lox7l序列、lox66序列、frt序列、bxbl attp序列、bxbl attb序列、attp序列和attb序列。
3.根据权利要求1所述的ti宿主细胞，其中所述rrs通过选自由以下项组成的组的重组酶来识别：cre重组酶、flp重组酶、bxbl整合酶和整合酶。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的ti宿主细胞，其中所述外源核苷酸序列包含位于最5'的rrs与在3'方向的下一个rrs之间的选择标志物。
5.根据权利要求4所述的ti宿主细胞，其中所述选择标志物选自由以下项组成的组：氨基糖苷磷酸转移酶(aph)、潮霉素磷酸转移酶(hyg)、新霉素、g418(aph)、二氢叶酸还原酶(dhfr)、胸苷激酶(tk)、谷氨酰胺合成酶(gs)、天冬酰胺合成酶、色氨酸合成酶(吲哚)、组氨醇脱氢酶(组氨醇d)、杀稻瘟菌素、博莱霉素、腐草霉素、氯霉素、吉欧霉素和霉酚酸。
6.根据权利要求5所述的ti宿主细胞，其进一步包含第二选择标志物，其中所述第一选择标志物和所述第二选择标志物是不同的。
7.根据权利要求6所述的ti宿主细胞，其中所述第二选择标志物选自由以下项组成的组：氨基糖苷磷酸转移酶(aph)、潮霉素磷酸转移酶(hyg)、新霉素、g418(aph)、二氢叶酸还原酶(dhfr)、胸苷激酶(tk)、谷氨酰胺合成酶(gs)、天冬酰胺合成酶、色氨酸合成酶(吲哚)、组氨醇脱氢酶(组氨醇d)、杀稻瘟菌素、博莱霉素、腐草霉素、氯霉素、吉欧霉素和霉酚酸。
8.根据权利要求6所述的ti宿主细胞，其进一步包含第三选择标志物和内部核糖体进入位点(ires)，其中所述ires与第三选择标志物可操作地连接。
9.根据权利要求8所述的ti宿主细胞，其中所述第三选择标志物不同于所述第一选择标志物或所述第二选择标志物。
10.根据权利要求9所述的ti宿主细胞，其中所述第三选择标志物选自由以下项组成的组：绿色荧光蛋白(gfp)标志物、增强型gfp(egfp)标志物、合成gfp标志物、黄色荧光蛋白(yfp)标志物、增强型yfp(eyfp)标志物、蓝绿色荧光蛋白(cfp)标志物、mplum标志物、mcherry标志物、tdtomato标志物、mstrawberry标志物、j-red标志物、dsred-单体标志物、morange标志物、mko标志物、mcitrine标志物、venus标志物、ypet标志物、emerald6标志物、cypet标志物、mcfpm标志物、cerulean标志物和t-sapphire标志物。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的ti宿主细胞，其中所述ti宿主细胞为哺乳动物宿主细胞。
12.根据权利要求11所述的ti宿主细胞，其中所述ti宿主细胞为仓鼠宿主细胞、人类宿主细胞、大鼠宿主细胞或小鼠宿主细胞。
13.根据权利要求11或12所述的ti宿主细胞，其中所述ti宿主细胞为中国仓鼠卵巢(cho)宿主细胞、cho k1宿主细胞、cho k1 sv宿主细胞、dg44宿主细胞、dukxb-1 1宿主细胞、chok1 s宿主细胞或cho k1m宿主细胞。
14.一种制备表达目标序列(soi)的ti宿主细胞的方法，所述方法包括：
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述重组酶选自cre重组酶、flp重组酶、bxbl整合酶和整合酶。
16.根据权利要求14至15中任一项所述的方法，其中所述soi编码单链抗体、抗体轻链、抗体重链、单链fv片段(scfv)或fc融合蛋白。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的方法，其中所述ti宿主细胞为哺乳动物宿主细胞。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述ti宿主细胞为仓鼠宿主细胞...
【专利技术属性】
技术研发人员：C·K·D·吴，A·申，G·C·巴纳德，
申请(专利权)人：基因泰克公司，
类型：发明
国别省市：
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