【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程，具体涉及一种sgrna、crispr/fpcas9基因编辑系统及其应用。
技术介绍
1、crispr/cas9是一种革命性的基因编辑技术，它源自细菌的免疫系统，这种系统能够识别并切割特定的dna序列，从而实现对基因组的精确编辑。crispr/cas9系统主要由cas9酶和单导向rna（sgrna）组成。cas9负责切割dna双链，而sgrna则负责引导cas9到特定的基因位置。当sgrna与目标dna序列配对时，cas9酶会在一个特定的序列（pam）附近切割dna，导致双链断裂，这种断裂可以被细胞的修复机制利用，从而实现基因的敲除、插入或替换。spcas9是crispr-cas9系统中的一种cas9酶，源自化脓链球菌（streptococcuspyogenes），是目前应用最广泛的基因编辑工具之一。
2、当前常用的商业化crispr/cas9系统，源自化脓链球菌（ streptococcus pyogenecas，spcas9）的的ii型crispr系统，因其在适当条件下切割效率高，成为了现下应用最为广泛的基因编辑系统，这一系统通过识别序列为ngg的pam来靶向切割目的片段。但是该系统存在如下缺点：（1）这一系统通过识别序列为ngg的pam靶向切割。然而，这一pam要求也限制了spcas9的应用，某些靶位点可能因存在较少gg而无法使用spcas9进行识别与编辑。（2）这一系统最适作用温度为37℃，这一温度条件是为了确保酶的活性和效率，从
3、因此，基于现有ii型crispr/cas9系统存在的不足，急需开发新的适用于低温环境的crispr/cas基因编辑系统。
技术实现思路
1、为了解决现有技术中的不足，本专利技术旨在提供一种sgrna、crispr/fpcas9基因编辑系统及其应用。
2、本专利技术的具体技术方案如下：
3、本专利技术提供一种sgrna，所述sgrna自5’端至3’端包括spacer序列和sgrnascaffold序列，所述spacer序列与靶dna序列互补配对，紧邻所述靶dna序列的3’端具有pam位点，所述pam位点为5’-ana-3’，n表示a、g、c、t中的任一种，所述sgrna scaffold序列自5’端至3’端包括第一区段和第二区段，第一区段和第二区段通过gaaa连接，所述第一区段选自如seq id no. 22所示的第一序列或第一序列的截短序列，第一序列的截短序列包含如seq id no. 23所示的第一序列的核心序列，第二区段选自如seq id no. 3所示的第二序列或第二序列的截短序列，第二序列的截短序列包含如seq id no. 9所示的第二序列的核心序列。
4、进一步地，所述spacer序列的长度为20-30nt，优选为20-24nt。
5、进一步地，所述第一序列的截短序列选自seq id no. 23、seq id no. 24或seqid no. 25所示的序列；
6、和/或，所述第二序列的截短序列选自seq id no. 5、seq id no. 6、seq id no.7、seq id no. 8或seq id no. 9所示的序列；
7、优选地，所述sgrna scaffold序列的如seq id no. 15所示。
8、本专利技术还提供一种crispr/fpcas9基因编辑系统，其包括fpcas9蛋白和所述的sgrna，所述fpcas9蛋白的氨基酸序列如seq id no. 1所示，所述fpcas9蛋白识别的pam位点为5’-ana-3’，n表示a、g、c、t中的任一种。
9、进一步地，所述crispr/fpcas9基因编辑系统的切割温度为5-25℃。
10、本专利技术还提供一种多核苷酸，其为下述任一项多核苷酸：
11、（1）编码所述sgrna的多核苷酸；
12、（2）编码所述sgrna和所述fpcas9蛋白的多核苷酸；
13、（3）编码所述sgrna的多核苷酸，以及编码所述fpcas9蛋白的多核苷酸的组合物。
14、本专利技术还提供一种表达载体，其为下述任一项表达载体：
15、（1）含有编码所述sgrna的多核苷酸的表达载体；
16、（2）含有编码所述sgrna和所述fpcas9蛋白的多核苷酸的表达载体；
17、（3）含有编码所述sgrna的多核苷酸的表达载体，以及含有编码所述fpcas9蛋白的多核苷酸的表达载体的组合物。
18、本专利技术还提供一种细胞，其包含所述的表达载体。
19、本专利技术还提供所述crispr/fpcas9基因编辑系统在基因编辑中的应用。
20、本专利技术还提供所述表达载体在构建crispr/fpcas9基因编辑系统中的应用。
21、本专利技术还提供一种基因编辑的方法，构建所述的crispr/fpcas9基因编辑系统，所述sgrna引导fpcas9蛋白结合至所述靶dna序列，实现对基因的编辑；
22、优选地，使用所述的表达载体构建所述的crispr/fpcas9基因编辑系统；
23、优选地，所述crispr/fpcas9基因编辑系统的切割温度为5-25℃。
24、本专利技术的有益效果为：
25、（1）本专利技术提供的ii型crispr/fpcas9基因编辑系统可以识别特定的pam序列(ana)，能够在sgrna的引导下在原核环境或真核细胞中行使基因编辑功能，增加了基因编辑操作可靶向的范围，克服了spcas9的局限性。
26、（2）本专利技术中涉及到的fpcas9在5-25℃的切割活性显著优于spcas9，适用于低温环境下的基因编辑操作。
27、（3）本专利技术对预测到的tracrrna和crrna的全长序列进行了进一步的截断，并通过设计loop环，让其两者成为一条单链rna，在使用中只需要体外转录一条sgrna便可引导fpcas9进行靶向工作。
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1. 一种sgRNA，其特征在于，其自5’端至3’端包括Spacer序列和sgRNA scaffold序列，所述Spacer序列与靶DNA序列互补配对，紧邻所述靶DNA序列的3’端具有PAM位点，所述PAM位点为5’-ANA-3’，N表示A、G、C、T中的任一种，所述sgRNA scaffold序列自5’端至3’端包括第一区段和第二区段，第一区段和第二区段通过GAAA连接，所述第一区段选自如SEQ IDNO. 22所示的第一序列或第一序列的截短序列，第一序列的截短序列包含如SEQ ID NO.23所示的第一序列的核心序列，第二区段选自如SEQ ID NO. 3所示的第二序列或第二序列的截短序列，第二序列的截短序列包含如SEQ ID NO. 9所示的第二序列的核心序列。
2.根据权利要求1所述的sgRNA，其特征在于，所述Spacer序列的长度为20-30nt。
3. 根据权利要求1所述的sgRNA，其特征在于，所述第一序列的截短序列选自SEQ IDNO. 23、SEQ ID NO. 24或SEQ ID NO. 25所示的序列；
4. 根据权利要
5. 一种CRISPR/FpCas9基因编辑系统，其特征在于，其包括FpCas9蛋白和权利要求1所述的sgRNA，所述FpCas9蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述FpCas9蛋白识别的PAM位点为5’-ANA-3’，N表示A、G、C、T中的任一种。
6. 根据权利要求5所述的CRISPR/FpCas9基因编辑系统，其特征在于，所述CRISPR/FpCas9基因编辑系统的切割温度为5-25℃。
7.一种多核苷酸，其特征在于，其为下述任一项多核苷酸：
8.一种表达载体，其特征在于，其为下述任一项表达载体：
9.权利要求5所述CRISPR/FpCas9基因编辑系统在基因编辑中的应用。
10.一种基因编辑的方法，其特征在于，构建权利要求5所述的CRISPR/FpCas9基因编辑系统，所述sgRNA引导FpCas9蛋白结合至所述靶DNA序列，实现对基因的编辑；所述CRISPR/FpCas9基因编辑系统的切割温度为5-25℃。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，使用权利要求8所述的表达载体构建权利要求5所述的CRISPR/FpCas9基因编辑系统。
...【技术特征摘要】
1. 一种sgrna，其特征在于，其自5’端至3’端包括spacer序列和sgrna scaffold序列，所述spacer序列与靶dna序列互补配对，紧邻所述靶dna序列的3’端具有pam位点，所述pam位点为5’-ana-3’，n表示a、g、c、t中的任一种，所述sgrna scaffold序列自5’端至3’端包括第一区段和第二区段，第一区段和第二区段通过gaaa连接，所述第一区段选自如seq idno. 22所示的第一序列或第一序列的截短序列，第一序列的截短序列包含如seq id no.23所示的第一序列的核心序列，第二区段选自如seq id no. 3所示的第二序列或第二序列的截短序列，第二序列的截短序列包含如seq id no. 9所示的第二序列的核心序列。
2.根据权利要求1所述的sgrna，其特征在于，所述spacer序列的长度为20-30nt。
3. 根据权利要求1所述的sgrna，其特征在于，所述第一序列的截短序列选自seq idno. 23、seq id no. 24或seq id no. 25所示的序列；
4. 根据权利要求1所述的sgrna，其特征在于，所述sgrna scaffold序列的如seq idno...
【专利技术属性】
技术研发人员：李绍戊，赵然，郑先虎，王婧，朱健强，王荻，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，
类型：发明
国别省市：
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