【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及合成生物学，尤其涉及生产儿茶酚的微生物细胞工厂。
技术介绍
1、儿茶酚，又名邻苯二酚，是一种有机化合物，化学式为c6h6o2，为白色结晶性粉末。儿茶酚含两个相邻的羟基，具有良好的抗氧化和抗菌特性。儿茶酚还是农药、调味剂、药物和生物材料化学合成的重要中间体，可用作橡胶硬化剂、电镀添加剂、皮肤防腐杀菌剂、染发剂、照相显影剂和彩照抗氧化剂等。
2、目前儿茶酚的获得主要通过化学合成，但化学合成工艺复杂，副产品多，反应条件难以控制，使得儿茶酚的产量始终供不应求。而微生物法因其反应快速、适合工业规模生产、环保及无溶剂的特点逐渐受到关注。
3、木质素是木质纤维素生物质的主要成分，也是世界上最大的可再生芳香族化合物来源。每年约有1500亿吨木质素被生产，然而，绝大部分木质素被用于燃烧和发电，导致资源浪费与环境污染。通过微生物可以将木质素转化为儿茶酚，首先，微生物分泌木质素降解酶，如木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶等，将木质素解聚。然后，经过一系列氧化还原反应和酶促反应，把解聚后的产物进一步转化为儿茶酚。因此，通过微生物法将木质素转化为儿茶酚是实现木质素增值和儿茶酚生产的有前途的方法。
4、具有多种木质素衍生物代谢途径的恶臭假单胞菌是木质素生物转化的良好底盘，通过基因编辑与代谢调控的手段能够实现木质素向儿茶酚的高效转化。目前，已有研究在恶臭假单胞菌中通过敲除下游降解途径、引入来自阴沟肠杆菌的原儿茶酸脱羧酶和不动杆菌属的香草酸o-脱甲基酶的方法使阿魏酸与对香豆酸单体转化为儿茶酚，但最高效率仅为6％和6
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供生产儿茶酚的微生物细胞工厂。
2、本专利技术以恶臭假单胞菌为底盘细胞，重点针对中间产物积累与异源表达效率低的问题提出解决的方法，提供了一种恶臭假单胞菌的代谢调控策略，为木质素的生物转化提供了一种有前景的方案。
3、本专利技术提供的产儿茶酚的菌株，其为含有如下i)～iv)中至少一项的恶臭假单胞菌；
4、i)、编码原儿茶酸脱羧酶的核酸；
5、ii)、编码香草酸o-脱甲基酶加氧酶的核酸；
6、iii)、编码4-羟基苯甲酸3-单加氧酶的核酸；
7、iv)、编码异戊烯基转移酶的核酸。
8、本专利技术中对原儿茶酸脱羧酶的来源进行了筛选，例如：来自enterobactercloacae(阴沟肠杆菌)的aroy、来自klebsiella pneumoniae(肺炎伯克菌)的pdc、以及来自talaromyces atroroseus(暗玫瑰篮状菌)的tagdc。多个来源的原儿茶酸脱羧酶中，来自阴沟肠杆菌的原儿茶酸脱羧酶能够获得更高的转化率；本专利技术对编码原儿茶酸脱羧酶的核酸进行密码子优化，使其更符合恶臭假单胞菌原有基因组特点，并在5’端加入rbs序列tagaaaacctcctta。相对于其它优化方案，所述编码原儿茶酸脱羧酶的核酸如seq id no:1所示则效果更优。
9、本专利技术中，所述香草酸o-脱甲基酶加氧酶为来自恶臭假单胞菌的香草酸o-脱甲基酶加氧酶；本专利技术在编码香草酸o-脱甲基酶加氧酶的核酸的5’端加入rbs序列tagaaaacctcctta。编码香草酸o-脱甲基酶加氧酶的核酸如seq id no:2所示。
10、本专利技术中，所述4-羟基苯甲酸3-单加氧酶为来自恶臭假单胞菌的4-羟基苯甲酸3-单加氧酶；本专利技术在编码4-羟基苯甲酸3-单加氧酶的核酸的5’端加入rbs序列tagaaaacctcctta。编码4-羟基苯甲酸3-单加氧酶的核酸如seq id no:3所示。
11、本专利技术还对异戊烯基转移酶的来源进行了筛选，例如：来自enterobactercloacae(阴沟肠杆菌)的ecdb、来自klebsiella pneumoniae(肺炎伯克菌)的kpdb、来自e.coli(大肠杆菌)的ubix，来自yeast(酵母)的padi。作为优选，所述异戊烯基转移酶为来自肺炎伯克菌的异戊烯基转移酶，能够获得更高的转化率；本专利技术对编码异戊烯基转移酶的核酸进行密码子优化，使其更符合恶臭假单胞菌原有基因组特点，并在5’端加入rbs序列tagaaaacctcctta。相对于其它优化方案，所述编码异戊烯基转移酶的核酸如seq id no:4所示获得的效果更优。
12、具体实施例中，所述菌株中含有编码原儿茶酸脱羧酶的核酸、编码香草酸o-脱甲基酶加氧酶的核酸、编码4-羟基苯甲酸3-单加氧酶的核酸和编码异戊烯基转移酶的核酸。更具体的，本专利技术利用enterobacter cloacae来源的原儿茶酸脱羧酶aroy与klebsiellapneumoniae来源的异戊烯基转移酶在恶臭假单胞菌中异源表达，提高原儿茶酸脱羧酶转化效率，通过过表达内源关键酶基因poba与vanab表达消除中间产物，以提高儿茶酚产量。
13、一些实施例中，所述菌株中表达原儿茶酸脱羧酶、香草酸o-脱甲基酶加氧酶、4-羟基苯甲酸3-单加氧酶或异戊烯基转移酶中任意一种。
14、一些实施例中，所述菌株中表达：
15、原儿茶酸脱羧酶和香草酸 o - 脱甲基酶加氧酶；
16、或表达原儿茶酸脱羧酶和 4 - 羟基苯甲酸 3 - 单加氧酶；
17、或表达原儿茶酸脱羧酶和异戊烯基转移酶；
18、或表达香草酸 o - 脱甲基酶加氧酶和 4 - 羟基苯甲酸 3 - 单加氧酶；
19、或表达香草酸 o - 脱甲基酶加氧酶和异戊烯基转移酶；
20、或表达4-羟基苯甲酸3-单加氧酶和异戊烯基转移酶。
21、另一些实施例中，所述菌株中表达：
22、原儿茶酸脱羧酶、香草酸o-脱甲基酶加氧酶和4-羟基苯甲酸3-单加氧酶。
23、或表达原儿茶酸脱羧酶、香草酸o-脱甲基酶加氧酶和异戊烯基转移酶。
24、或表达原儿茶酸脱羧酶、4-羟基苯甲酸3-单加氧酶和异戊烯基转移酶。
25、或表达香草酸o-脱甲基酶加氧酶、4-羟基苯甲酸3-单加氧酶和异戊烯基转移酶。
26、本专利技术中，所述的恶臭假单胞菌中pcahg基因、cata基因和cata2基因被敲除。其中，所述pcahg基因为原儿茶酸3,4-双加氧酶、所述cata基因为儿茶酚降解酶，所述cata2基因为儿茶酚降解酶。本专利技术以敲除了pcahg基因、cata基因和cata2基因的恶臭假单胞菌为底盘菌，在其中引入外源aroy、vanab、poba和/或kpdb基因。通过强化内源关键酶基因表达且过表达异戊烯基转移酶增强辅因子供应以提高儿茶酚产量。
27、进一步的，本专利技术还提供了如前所述菌株的构建方法，其包括：
28、构建含有编码原儿茶酸脱羧酶的核酸、编码香草酸o-脱甲基酶加氧酶香草酸o-脱甲基酶加氧酶的核酸、编码4-羟基苯甲酸3-单加氧酶的核酸和编码异戊烯基转移酶的核酸中至少本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.产儿茶酚的菌株，其为含有如下I)～IV)中至少一项的恶臭假单胞菌；
2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，
3.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，
4.根据权利要求1～3任一项所述的菌株，其特征在于，其中含有编码原儿茶酸脱羧酶的核酸、编码香草酸O-脱甲基酶加氧酶的核酸、编码4-羟基苯甲酸3-单加氧酶的核酸和编码异戊烯基转移酶的核酸。
5.根据权利要求1～3任一项所述的菌株，其特征在于，其中pcaHG基因catA基因和catA2基因被敲除。
6.权利要求1～5任一项所述菌株的构建方法，其包括：
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，还包括敲除pcaHG基因catA基因和catA2基因的步骤。
8.儿茶酚的制备方法，其包括：以阿魏酸和/或对香豆酸为底物，以权利要求1～5任一项所述菌株进行发酵，获得含有儿茶酚的产物。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述发酵的培养基中包括：20g/L葡萄糖、5mM阿魏酸和5mM对香豆酸的M9培养基。
10.根据权
...【技术特征摘要】
1.产儿茶酚的菌株，其为含有如下i)～iv)中至少一项的恶臭假单胞菌；
2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，
3.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，
4.根据权利要求1～3任一项所述的菌株，其特征在于，其中含有编码原儿茶酸脱羧酶的核酸、编码香草酸o-脱甲基酶加氧酶的核酸、编码4-羟基苯甲酸3-单加氧酶的核酸和编码异戊烯基转移酶的核酸。
5.根据权利要求1～3任一项所述的菌株，其特征在于，其中pcahg基因cata基因和cata2基因被敲除。
6.权利要求1～5任一项所述菌株的构建方法，其包括...
【专利技术属性】
技术研发人员：李霞，周亚，刘若盈，刘志华，李炳志，元英进，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。