【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药，涉及一种检测试剂对黄嘌呤氧化酶抑制作用的方法。
技术介绍
1、黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，xo)是一种广泛存在于哺乳动物体内的酶，在嘌呤代谢过程中起着关键作用。它与多种生理和病理过程密切相关，包括尿酸生成、氧化应激反应等。痛风是由于尿酸生成过多或排泄减少导致尿酸盐在关节等部位沉积引起的疾病，临床常用治疗药物包括别嘌醇、苯溴马隆和非布司他等，但这些药物均存在明显的副作用，因此本领域将研发重点放在更安全、更高效的新型降尿酸药物，而由于黄嘌呤氧化酶是尿酸生成的关键酶，因此筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂成为本领域的主要研发方向之一。
2、近年来，随着技术的不断发展，黄嘌呤氧化酶的体外研究体系也取得了显著的进展。目前评价化合物对黄嘌呤氧化酶抑制作用的试验体系主要有以下几种：1.酶学试验体系，应用市售的黄嘌呤氧化酶，如来源于牛乳或通过微生物等表达纯化的重组酶，通过加入底物和化合物反应后检测产物生成量来判断化合物是否存在抑制作用，如cn102095825a公开利用超高效液相色谱和质谱联用筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法，该方法虽然简单，但由于其不能完全反映体内复杂的生理环境和药物代谢过程，因此其结果可能与体内实际情况存在一定差异；2.细胞水平试验体系，应用人或动物的细胞系，通过加入底物和化合物反应后检测产物生成量来判断化合物是否存在抑制作用，该方法虽然可以综合考虑细胞对化合物的摄取、代谢以及细胞内环境对酶活性的影响等因素进而评估化合物对酶活性的抑制，但由于细胞系在培养过程中发生的改变，使其功能或酶活
3、综上所述，目前筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂的方法虽然从一定程度上能应用于筛选黄嘌呤氧化酶的抑制剂，但由于各种原因不能很好地外推人体内的结果，因此，亟需开发一种能够有效外推人体内的结果的黄嘌呤氧化酶抑制剂筛选方法。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种检测试剂对黄嘌呤氧化酶抑制作用的方法及其应用，开发应用原代肝细胞评价试剂对黄嘌呤氧化酶抑制作用的试验体系，进一步开发能够有效外推人体内的结果的黄嘌呤氧化酶抑制剂筛选方法。
2、为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供了一种检测试剂对黄嘌呤氧化酶抑制作用的方法，所述方法包括：
4、按如下方式设置实验，实验组：取原代肝细胞与待检测试剂溶液混合孵育，加入黄嘌呤溶液；阴性对照组：取原代肝细胞与细胞培养基混合孵育，加入黄嘌呤溶液；空白对照组：取原代肝细胞与细胞培养基混合孵育，加入细胞培养基；
5、检测实验组、阴性对照组和空白对照组尿酸生成浓度，按式(1)计算实验组或阴性对照组尿酸的净生成浓度，式(1)：尿酸的净生成浓度＝(实验组或阴性对照组尿酸生成浓度)-空白对照组尿酸生成浓度平均值；
6、按式(2)计算实验组或阴性对照组尿酸生成速率，式(2)：尿酸生成速率＝(实验组或阴性对照组尿酸净生成浓度)/反应时间/细胞浓度；
7、按式(3)计算实验组或阴性对照组黄嘌呤氧化酶的相对活性，式(3)：相对活性＝试验组尿酸生成速率/阴性对照组尿酸生成速率×100％；
8、根据所述相对活性评估待检测试剂对黄嘌呤氧化酶的抑制作用。
9、本专利技术中，设计全新的检测试剂对黄嘌呤氧化酶抑制作用的方法，基于原代肝细胞中黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤合成尿酸的反应，设置特定的抑制实验过程以及计算评估方法，能够高效准确评估待检测试剂对于原代肝细胞中黄嘌呤氧化酶的抑制作用，且原代肝细胞具有高度生理相关性和完整的代谢功能，更利于有效外推人体内的结果。
10、本专利技术中，所述原代肝细胞是指从人体或其它动物肝脏组织中直接分离出来的肝细胞。
11、可以理解，为保证实验对比合理性，实验组、阴性对照组和空白对照组中各阶段加入试剂用量以及反应条件等需控制相同或极小差异，以避免非相关因素对结果造成的干扰。
12、可以理解，所述待检测试剂可以为任意的单质或化合物。
13、优选地，所述细胞培养基为含有l-谷氨酰胺、胎牛血清、非必需氨基酸、胰岛素、氢化可的松、nahco3、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、白蛋白、d-果糖、庆大霉素、阿米卡星和两性霉素b的基础培养基。
14、优选地，所述细胞培养基为含有2mm～4mml-谷氨酰胺、5％～10％胎牛血清、1％～2％非必需氨基酸、0.1μm～0.2μm胰岛素、0.1μm～0.2μm氢化可的松、0.2％～0.3％nahco3、2mm～10mm 4-羟乙基哌嗪乙磺酸、0.2％～0.3％白蛋白、0.04％～0.06％d-果糖、0.02mg/ml～0.06mg/ml庆大霉素、0.02mg/ml～0.06mg/ml阿米卡星和0.25ng/ml～0.75ng/ml两性霉素b的基础培养基。
15、优选地，所述非必需氨基酸包括l-丙氨酸、l-天冬酰胺、l-天冬氨酸、l-甘氨酸、l-丝氨酸、l-脯氨酸和l-谷氨酸。
16、优选地，所述基础培养基包括dmem培养基。
17、优选地，所述黄嘌呤溶液的溶剂为所述细胞培养基。
18、优选地，所述待检测试剂溶液的溶剂为所述细胞培养基。
19、本专利技术中，可根据试剂需求设计黄嘌呤和待检测试剂的工作浓度，例如黄嘌呤的工作浓度为40～60μg/ml，待检测试剂的工作浓度为0.03～3μm等。
20、优选地，所述实验组、阴性对照组和空白对照组的反应时间为10～90min，包括但不限于15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80或85min等，温度为36～38℃。
21、本专利技术中，底物黄嘌呤的使用浓度和反应的时间根据尿酸在梯度时间时的生成试验进行设计调整，能够选取合适的底物浓度和反应时间，更准确的反应试验结果。
22、优选地，所述实验组、阴性对照组和空白对照组的反应的终止液包括甲苯磺丁脲溶液。
23、优选地，所述原代肝细胞包括人原代肝细胞。
24、优选地，所述原代肝细胞的密度为0.1×106～2×106个/ml。
25、优选地，所述尿酸生成浓度的检测方法包括液相色谱与串本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测试剂对黄嘌呤氧化酶抑制作用的方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的检测试剂对黄嘌呤氧化酶抑制作用的方法，其特征在于，所述细胞培养基为含有L-谷氨酰胺、胎牛血清、非必需氨基酸、胰岛素、氢化可的松、NaHCO3、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、白蛋白、D-果糖、庆大霉素、阿米卡星和两性霉素B的基础培养基。
3.根据权利要求1或2所述的检测试剂对黄嘌呤氧化酶抑制作用的方法，其特征在于，所述黄嘌呤溶液的溶剂为所述细胞培养基；
4.根据权利要求1-3任一项所述的检测试剂对黄嘌呤氧化酶抑制作用的方法，其特征在于，所述实验组、阴性对照组和空白对照组的反应时间为10～90min，温度为36～38℃。
5.根据权利要求4所述的检测试剂对黄嘌呤氧化酶抑制作用的方法，其特征在于，所述实验组、阴性对照组和空白对照组的反应的终止液包括甲苯磺丁脲溶液。
6.根据权利要求1-5任一项所述的检测试剂对黄嘌呤氧化酶抑制作用的方法，其特征在于，所述原代肝细胞包括人原代肝细胞。
7.根据权利要求1-6任一项所述的检测试剂对黄
8.根据权利要求1-7任一项所述的检测试剂对黄嘌呤氧化酶抑制作用的方法，其特征在于，所述尿酸生成浓度的检测方法包括液相色谱与串联质谱联用法，具体包括取所述实验组、阴性对照组和空白对照组的反应后溶液进行离心收集上清，进行液相色谱与串联质谱联用检测。
9.根据权利要求1-8任一项所述的检测试剂对黄嘌呤氧化酶抑制作用的方法，其特征在于，所述方法还包括对半数抑制浓度IC50和95％置信区间进行拟合的步骤，拟合公式如式(4)所示；
10.权利要求1-8任一项所述的检测试剂对黄嘌呤氧化酶抑制作用的方法在筛选黄嘌呤氧化酶抑制剂中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种检测试剂对黄嘌呤氧化酶抑制作用的方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的检测试剂对黄嘌呤氧化酶抑制作用的方法，其特征在于，所述细胞培养基为含有l-谷氨酰胺、胎牛血清、非必需氨基酸、胰岛素、氢化可的松、nahco3、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、白蛋白、d-果糖、庆大霉素、阿米卡星和两性霉素b的基础培养基。
3.根据权利要求1或2所述的检测试剂对黄嘌呤氧化酶抑制作用的方法，其特征在于，所述黄嘌呤溶液的溶剂为所述细胞培养基；
4.根据权利要求1-3任一项所述的检测试剂对黄嘌呤氧化酶抑制作用的方法，其特征在于，所述实验组、阴性对照组和空白对照组的反应时间为10～90min，温度为36～38℃。
5.根据权利要求4所述的检测试剂对黄嘌呤氧化酶抑制作用的方法，其特征在于，所述实验组、阴性对照组和空白对照组的反应的终止液包括甲苯磺丁脲溶液。
6.根据权...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡卓汉，郝祝兵，佘桂仙，彭俊英，李楠，
申请(专利权)人：瑞德肝脏疾病研究上海有限公司，
类型：发明
国别省市：
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