【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及一种可同时检测猪肉中16种致病病原的液相芯片方法。
技术介绍
1、人畜共患病种类很多，其中食源性人畜共患病与人类的食品安全密切相关。猪肉是食源性人畜共患病原重要的传播的媒介。据监测数据分析，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、志贺菌、沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌、蜡样芽胞杆菌、单增李斯特菌，其中旋毛虫、弓形虫、囊尾蚴等也是影响猪肉安全的危害性较大病原。这些致病病原不仅影响猪肉及其制品的质量安全，还给消费者带来健康隐患，甚至危及生命。因此，猪肉质量安全对生猪产业链具有直接影响，是产品质量安全的前提保障。
2、液相芯片技术通过光谱指纹把微球划分为很多不同的分区，每种微球可以偶联针对特定的生物检测目标的不同的核酸或者蛋白，因此可以在一个样品中同时捕获到不同待检物。由于微球的尺寸和反应体系中的低密度，使生物芯片反应体系由液相—固相反应改为接近生物系统内部环境的完全液相反应体系，一次操作最多可以检测100个指标，还具有快速、敏感性高、检测范围广、重复性好、成本低、操作方便等优点。本研究选取16种致病病原：金黄色葡萄球菌、致病性大肠杆菌、志贺菌、沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌、蜡样芽胞杆菌、布鲁氏菌、单增李斯特菌、结肠弯曲杆菌、产气荚膜梭菌、猪丹毒杆菌、链球菌2型、旋毛虫、弓形虫、囊尾蚴、住肉孢子虫，是依据《中华人民共和国动物防疫法》并结合文献调研，对猪肉中多病原污染或携带进行风险识别基础上获得的16种为需优先管控的病原，研究旨在通过液相芯片平台建立一种快速、高通量的多重致病病原检测方法，可以为猪肉质量安全的实验
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种可同时检测猪肉中16种致病病原的液相芯片方法。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种同时快速检测猪肉中16种致病病原的核酸组合物，包括以下引物和探针序列：
4、表216种致病病原的引物和探针序列
5、
6、
7、。如seq id no:1～48所示。
8、在本专利技术中，w代表：a/t；y代表：c/t；r代表：a/g。
9、优选的，所述核酸组合物的下游引物的5'端连接生物素，探针的5'连接nh2-c12。
10、本专利技术还提供了一种同时快速检测猪肉中16种致病病原的试剂盒，包括所述的核酸组合物和微球。
11、优选的，还包括多重pcr mix、mes溶液、edc溶液、吐温20溶液、sds溶液、te溶液以及sape报告液。
12、本专利技术还提供了一种同时快速检测猪肉中16种致病病原的检测方法，包括如下步骤：
13、(1)以样本dna序列作为模板，利用所述的上游引物和下游引物进行多重pcr扩增，得到多重pcr产物；
14、(2)将所述的探针与微球按照体积比2～4:50进行偶联，获得液相芯片工作液；
15、(3)将所述多重pcr产物与液相芯片工作液按照体积比1:8～10混合杂交，再与sape进行孵育，检测mfi值；如定性比率结果≥6，则结果为阳性。
16、优选的，所述多重pcr扩增的总体系以50μl计，包括多重pcr mix25μl、上游引物7μl、下游引物7μl、模板dna2μl，再添加ddh2o至50μl。
17、优选的，多重所述pcr扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸1min；进行35循环；最后72℃延伸10min。
18、优选的，所述定性比率结果＝检测样品的mfi值/空白对照的mfi值。
19、优选的，所述上游引物中金黄色葡萄球菌、致病性大肠杆菌、志贺菌、单增李斯特菌、猪丹毒杆菌、囊尾蚴引物浓度均为0.35～0.45pmol/μl；住肉孢子虫引物浓度为0.5～1.5pmol/μl；沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌、蜡样芽胞杆菌、布鲁氏菌、结肠弯曲杆菌、产气荚膜梭菌、链球菌2型、旋毛虫、弓形虫引物浓度均为0.07～0.09pmol/μl；
20、所述下游引物中金黄色葡萄球菌、致病性大肠杆菌、志贺菌、单增李斯特菌、猪丹毒杆菌、囊尾蚴引物浓度均为0.35～0.45pmol/μl；住肉孢子虫引物浓度为0.5～1.5pmol/μl；沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌、蜡样芽胞杆菌、布鲁氏菌、结肠弯曲杆菌、产气荚膜梭菌、链球菌2型、旋毛虫、弓形虫引物浓度均为0.07～0.09pmol/μl。
21、优选的，步骤(3)所述杂交程序为93～97℃，5～10min；45～54℃，15～20min；所述孵育的温度为45～54℃，时间为5～20min。
22、与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果：
23、本专利技术提供了一种可以同时检测猪肉中16种致病病原的液相芯片方法，在猪肉被污染且原因未知时，可快速锁定感染的病原，具有快速、敏感性高、检测范围广、重复性好、综合检测成本低、操作方便等优点。
24、本专利技术方法与荧光定量pcr方法检测种类进行比较，目前多重荧光定量设备只能做到单孔4～5重信号检测(受限于荧光检测技术的原理)，即同时检测4～5种病原。本专利技术的方案解决了现有的荧光定量pcr检测方法病原检测种类少的问题，可单孔同时检测16种猪肉中常见的病原，大大提高了检出效率和病原检测范围。
25、通过本专利技术提供的实验可以看出，与荧光定量pcr方法检测敏感性进行比较，本专利技术方法对于11种病原液相芯片检测的拷贝数下限更低，4种检测拷贝下限与荧光定量pcr方法相同，说明本专利技术方法的检测敏感性更高。本专利技术的检测结果与阴性核酸相比，判定阳性标准是定性比率≥6，减少了检测误差，并加强对阴性阳性的判断，使结果更为准确。从核酸检测上讲，固相芯片是基于目标探针与靶向序列互补结合的定点捕获测序，而液相芯片则是通过微球体悬浮芯片技术进行抗原抗体、酶底物、配体受体的结合反应及核酸杂交反应。固相芯片可以部分替代液相芯片，但本专利技术提供的液相芯片的检测方法应用范围更加广泛。
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1.一种同时快速检测猪肉中16种致病病原的核酸组合物，其特征在于，包括以下引物和探针序列：
2.根据权利要求1所述的核酸组合物，其特征在于，所述核酸组合物的下游引物的5'端连接生物素，探针的5'连接NH2-C12。
3.一种同时快速检测猪肉中16种致病病原的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的核酸组合物和微球。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括多重PCR Mix、MES溶液、EDC溶液、吐温20溶液、SDS溶液、TE溶液以及SAPE报告液。
5.一种同时快速检测猪肉中16种致病病原的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述多重PCR扩增的总体系以50μL计，包括多重PCR Mix 25μL、上游引物7μL、下游引物7μL、模板DNA 2μL，再添加ddH2O至50μL。
7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，多重所述PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸1min；进行35循环；最后
8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述定性比率结果＝检测样品的MFI值/空白对照的MFI值。
9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述上游引物中金黄色葡萄球菌、致病性大肠杆菌、志贺菌、单增李斯特菌、猪丹毒杆菌、囊尾蚴引物浓度均为0.35～0.45pmol/μL；住肉孢子虫引物浓度为0.5～1.5pmol/μL；沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌、蜡样芽胞杆菌、布鲁氏菌、结肠弯曲杆菌、产气荚膜梭菌、链球菌2型、旋毛虫、弓形虫引物浓度均为0.07～0.09pmol/μL；
10.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤(3)所述杂交程序为93～97℃，5～10min；45～54℃，15～20min；所述孵育的温度为45～54℃，时间为5～20min。
...【技术特征摘要】
1.一种同时快速检测猪肉中16种致病病原的核酸组合物，其特征在于，包括以下引物和探针序列：
2.根据权利要求1所述的核酸组合物，其特征在于，所述核酸组合物的下游引物的5'端连接生物素，探针的5'连接nh2-c12。
3.一种同时快速检测猪肉中16种致病病原的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的核酸组合物和微球。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括多重pcr mix、mes溶液、edc溶液、吐温20溶液、sds溶液、te溶液以及sape报告液。
5.一种同时快速检测猪肉中16种致病病原的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述多重pcr扩增的总体系以50μl计，包括多重pcr mix 25μl、上游引物7μl、下游引物7μl、模板dna 2μl，再添加ddh2o至50μl。
7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：王君玮，赵格，韩亚星，赵建梅，张喜悦，刘俊辉，刘娜，王琳，
申请(专利权)人：中国动物卫生与流行病学中心，
类型：发明
国别省市：
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