【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程及微生物发酵，特别涉及一株可高效生产微菌素mccj25的重组菌株，并进一步公开其发酵产微菌素mccj25的方法及应用。
技术介绍
1、随着抗生素的广泛应用，抗生素耐药性已成为药物使用时应重点关注的问题。目前，许多国家已经全面禁止在动物饲料中使用抗生素作为生长促进剂，这使得寻找抗生素替代品变得越来越紧迫。
2、生物活性肽能够在较短时间内对病原微生物产生显著的抑制乃至杀灭功效，有利于迅速控制感染状况。相较于众多常规抗生素而言，活性多肽具备更低的毒性以及更少的副作用，且不容易引发耐药性。另外，生物活性肽能够对免疫系统功能进行调节，推动身体免疫力的提升，有助于防范和控制感染性疾病。鉴于活性多肽在对抗耐药菌株方面有着良好的成效，有望充当抗生素的替代产品，被用于治疗由耐药菌所引发的感染等。
3、微菌素microcin j25(mccj25)是一种大肠杆菌产生的由21个氨基酸组成的套索性多肽。这种独特的套索结构使其不仅具备抗菌肽的一般特点，还具有热稳定性好、耐酸性高以及对蛋白酶水解不敏感等突出优势。mccj25作为一种生物活性多肽，其能够与特定细菌蛋白相互作用，破坏细菌细胞膜的完整性，从而杀死致病菌，主要作用于革兰阴性细菌，包括致病性大肠杆菌、沙门氏菌和志贺菌等。其杀菌机制有别于一般抗生素，不易产生耐药性。此外，mccj25多肽还可以通过调节机体免疫力，维持正常的肠道菌群平衡，提高营养物质的吸收效率。
4、但是，由于mccj25多肽在天然获取方面存在限制，并且其合成所需成本颇高，因此，
技术实现思路
1、为此，本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种高产微菌素mccj25的重组菌株f-750，该重组菌株具有较好的mccj25发酵性能，可有效提高mccj25的表达量。
2、本专利技术所要解决的第二个技术问题在于提供一种菌株f-750发酵高产mccj25的工艺，所述发酵工艺具有较高的生产效率，可有效降低mccj25多肽的生产成本。
3、为解决上述技术问题，本专利技术所述的一种高产mccj25的重组菌株，所述重组菌株具有如下(a)-(c)项特征：
4、(a)将mcjabcd改造成三个表达框mcja、mcjbc、mcjd，并分别对启动子、rbs进行优化改造；
5、(b)将mcja、mcjbc表达框引入大肠杆菌表达质粒中；
6、(c)将mcjd表达框整合到大肠杆菌原始菌株基因组上。
7、本专利技术提供的一种生产微菌素mccj25的重组菌株f-750，为基于大肠杆菌重组工程菌株，通过基因编辑方法，将mcjd表达框插入大肠杆菌原始菌株的基因组，同时将含有mcja、mcjbc表达框的质粒引入大肠杆菌底盘中所得。
8、具体的，所述大肠杆菌原始菌株为大肠杆菌mc4100。
9、具体的，所述基因编辑方法为crispr-cas9。
10、具体的，所述mcjd表达框整合至mc4100菌株的基因组中，且所述mcja、mcjbc由质粒表达。
11、具体的，所述mcja、mcjbc、mcjd表达框经过表达元件优化，由不同的启动子、rbs等表达所得。
12、作为优选的重组菌株，本专利技术所述高产mccj25的重组菌株为大肠埃希氏菌f-750，其分类命名为escherichia coli，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.32623，保藏日期为2024年11月14日。
13、本专利技术还公开了一种所述高产mccj25的重组菌株的构建方法，包括如下步骤：
14、(1)通过基因合成和重叠pcr技术，获得带有靶基因同源臂的mcjd表达框，利用crispr-cas9基因编辑手段将其导入大肠杆菌原始菌株基因组中，从而获得底盘菌株；
15、(2)通过重叠pcr技术，获得mcja、mcjbc表达框，构建表达质粒；
16、(3)将构建的所述表达质粒导入所述新底盘菌株中，即得。
17、具体的，所述高产mccj25的重组菌株的构建方法，包括如下步骤：
18、根据mccj25基因簇的初始基因序列进行基因合成，通过pcr技术分别获得mcja、mcjbc、mcjd三种基因片段；
19、将挑选的不同类型启动子、rbs设计在引物中并进行合成，以mcja、mcjbc、mcjd三种基因片段为模板进行扩增，从而得到带有不同表达元件的mcja、mcjbc、mcjd表达框；
20、通过pcr和重叠pcr技术，构建带有靶基因同源臂的mcjd表达框片段，利用crispr-cas9基因编辑手段将其导入大肠杆菌原始菌株，得到底盘菌株并制备感受态；
21、具体的，所述步骤(2)中，将获得mcja、mcjbc表达框克隆至表达质粒，分别导入dh5α感受态中，从中挑选阳性转化子进行扩大培养，提取质粒，并将鉴定正确的重组质粒置于20℃保存备用；
22、具体的，所述步骤(3)中，将步骤(2)构建的质粒同时导入步骤(1)获得的底盘感受态中，得到生产mccj25的大肠杆菌工程菌株。
23、本专利技术还公开了一种大肠埃希氏菌f-750，其分类命名为大肠埃希氏菌escherichia coli，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.32623，保藏日期为2024年11月14日。
24、本专利技术还公开了所述高产mccj25的重组菌株f-750或所述大肠埃希氏菌f-750在发酵生产mccj25中的应用。
25、本专利技术还公开了一种发酵生产mccj25的方法，包括将所述高产mccj25的重组菌株f-750接种于适宜的发酵培养基中进行发酵培养的步骤。
26、具体的，所述发酵生产mccj25的方法，所述发酵培养步骤的条件包括：发酵温度36-38℃，通气比0.5-1vvm，转速350-400rpm，罐压0.03-0.05mpa，ph 6.9-7.1。
27、具体的，所述发酵生产mccj25的方法，所述发酵培养基包括如下质量浓度的组分：酵母提取物10-70g/l、硫酸镁0.5-5g/l、磷酸氢二钾0.5-5g/l、柠檬酸0-2g/l、葡萄糖1-10g/l、消泡剂0.1-1g/l，初始ph6.5-7.5。
28、本专利技术基于基因工程手段构建能够高产mccj25的重组菌株，本专利技术所述重组菌株通过对mccj25中的mcja、mcjbc、mcjd启动子、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高产Mccj25的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株具有如下(a)-(c)项特征：
2.根据权利要求1所述高产Mccj25的重组菌株，其特征在于，所述大肠杆菌原始菌株包括大肠杆菌MC4100；
3.根据权利要求1或2所述高产Mccj25的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为大肠埃希氏菌F-750，其分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.32623，保藏日期为2024年11月14日。
4.一种如权利要求1-3任一项所述高产Mccj25的重组菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述高产Mccj25的重组菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.一种大肠埃希氏菌F-750，其分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.32623，保藏日期为2024年11月14日。
7.权利要求1-4任一项所述
8.一种发酵生产Mccj25的方法，其特征在于，包括将权利要求1-4任一项所述高产Mccj25的重组菌株或者权利要求6所述大肠埃希氏菌F-750接种于适宜的发酵培养基中进行发酵培养的步骤。
9.根据权利要求8所述发酵生产Mccj25的方法，其特征在于，所述发酵培养步骤的条件包括：发酵温度36-38℃，通气比0.5-1vvm，转速350-400rpm，罐压0.03-0.05Mpa，pH 6.9-7.1。
10.根据权利要求8或9所述发酵生产Mccj25的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括如下质量浓度的组分：酵母提取物10-70g/L、硫酸镁0.5-5g/L、磷酸氢二钾0.5-5g/L、柠檬酸0-2g/L、葡萄糖1-10g/L、消泡剂0.1-1g/L，初始pH6.5-7.5。
...【技术特征摘要】
1.一种高产mccj25的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株具有如下(a)-(c)项特征：
2.根据权利要求1所述高产mccj25的重组菌株，其特征在于，所述大肠杆菌原始菌株包括大肠杆菌mc4100；
3.根据权利要求1或2所述高产mccj25的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为大肠埃希氏菌f-750，其分类命名为大肠埃希氏菌escherichia coli，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.32623，保藏日期为2024年11月14日。
4.一种如权利要求1-3任一项所述高产mccj25的重组菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述高产mccj25的重组菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.一种大肠埃希氏菌f-750，其分类命名为大肠埃希氏菌escherichia coli，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no....
【专利技术属性】
技术研发人员：江衍哲，杨子璇，任泽林，谢海箫，张叶，司先懂，
申请(专利权)人：北京英惠尔生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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