【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医药化学，具体涉及具有抗ev71病毒活性的牛耳枫生物碱化合物及其制备和应用。
技术介绍
1、肠道病毒71型(enterovirus 71，简称ev71)是引起婴幼儿手足口病(hand,footandmouth disease，hfmd)的主要病原体之一，能够通过排泄物、水、空气等途径快速传播，感染性强且致病率高，尤其是神经系统方面的并发症。各年龄组儿童均可感染发病，尤以3岁以下年龄组发病率最高，少数重症患儿可发生无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿等并发症，极少数病情危重，可致死亡。存活者可留有后遗症，严重危害儿童身体健康和生命安全，被喻为21世纪的“脊髓灰质炎”。ev71引起的手足口病在多地(如马来西亚沙捞越等)呈现每2–3年1次的周期性流行的趋势。ev71感染已成为全球，特别是亚太地区的一个重要公共卫生问题。ev71为单股正链rna病毒，属于小rna病毒目小rna病毒科肠道病毒属，基因组全长大约7500个碱基，仅有一个开放读码框架，编码一个多聚蛋白，这一多聚蛋白经进一步水解剪切后可产生病毒的4个结构蛋白(vp1-vp4)和7个非结构蛋白(2a-2c和3a-3d)，两侧为5′和3′非编码区(utrs)。病毒开始感染时，4种结构蛋白外形结构发生变化，变得易于结合宿主细胞，结合以后病毒开始复制，此时结构蛋白再次发生结构变化，使得蛋白内的单链rna易于进入到被感染的细胞体内，通过一系列的基因复制以及氨基酸编码后，初步组成病毒的前体蛋白，再由病毒自身的功能性蛋白修饰和切割，使得前体蛋白迅速的转化为ev71病毒蛋白，进而
2、目前，临床上的抗ev71病毒药物主要为利巴韦林和阿昔洛韦等，但其治疗效果有限，长期服用容易引起肝损伤。因此，研发具有特异性、高效低毒的抗ev71病毒药物对婴幼儿健康和社会发展具有十分重要的意义。其中，天然产物作为药物开发的重要来源之一，具有结构丰富多样，生物活性广泛等优点。因而挖掘自然界植物当中具有抗ev71病毒活性的天然产物具有非常重要的科学意义和开发前景。
技术实现思路
1、为了克服上述现有技术的不足，本专利技术从牛耳枫(daphniphyllum calycinum)枝叶中分离到四个新型的生物碱类化合物，这些化合物均具有较好的抗ev71病毒的活性，可以用于制备抗ev71先导化合物及抗病毒药物，为研究与开发新的抗ev71药物提供了候选化合物。
2、为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：
3、本专利技术第一方面提供了牛耳枫生物碱类化合物，所述牛耳枫生物碱类化合物包括化合物1–4中的至少一种，所述化合物1–4的结构式如下所示：
4、
5、优选地，所述牛耳枫生物碱类化合物包括化合物3、4中的至少一种，所述化合物3、4的结构式如下所示：
6、
7、本专利技术提供的生物碱类化合物3、4在ev71(moi＝0.1)感染48h后，化合物ec50分别为2.826μg/ml、3.783μg/ml。在相同感染条件下，化合物3、4的ec50均比利巴韦林小(ribavirin的ec50为65.770μg/ml)，说明其具有较好的抗ev71病毒的活性，可以用于制备抗ev71先导化合物及抗病毒药物，为研究与开发新的抗ev71药物提供了候选化合物。
8、本专利技术第二方面提供了第一方面所述的牛耳枫生物碱类化合物在制备抗ev71病毒药物或防治ev71病毒诱发的婴幼儿手足口病的药物中的应用。
9、本专利技术第三方面提供了一种抗ev71药物，所述抗ev71药物以化合物1–4中的至少一种作为活性成分，所述化合物1–4的结构式如下所示：
10、
11、优选地，所述抗ev71药物以化合物3、4中的至少一种作为活性成分，所述化合物3、4的结构式如下所示：
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13、优选地，所述抗ev71药物还包括药学上可接受的辅料。
14、更优选地，所述辅料为可用于药学领域的稀释剂、黏合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、稳定剂等以及一些药用基质；也可以是药物领域中可得到的功能性药用辅料，包括表面活性剂、助悬剂、乳化剂以及一些新型药用高分子材料，如环糊精、壳聚糖、聚乳酸(pla)、聚乙醇酸聚乳酸共聚物(plga)、透明质酸等。
15、优选地，所述抗ev71药物的剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊剂、滴丸剂、缓释剂、口服液制剂、针粉剂、注射剂。
16、优选地，所述抗ev71药物的给药方式包括口服、注射。
17、本专利技术的药物制剂可以经口服或胃肠外方式(例如静脉、皮下、腹膜内或局部)给药，即可通过口服、皮下注射、肌肉注射和静脉注射等多种方式灵活给药。如果某些药物在胃部条件下是不稳定的，可将其制备成肠衣片剂。
18、本专利技术第四方面还提供四个牛耳枫生物碱类化合物的制备方法，包括以下步骤：
19、(1)用乙醇溶液对干燥牛耳枫枝叶进行浸泡提取，通过旋转减压回收溶剂后得到浸膏；
20、(2)用水溶解浸膏，调节水溶液ph；
21、(3)采用乙酸乙酯对步骤(2)的水溶液进行萃取，对萃取后的水层调节ph，并用二氯甲烷再次萃取，浓缩；
22、(4)将步骤(3)的水层采用二氯甲烷进行萃取，浓缩；
23、(5)对二氯甲烷层浸膏进行分离纯化，纯化后得到牛耳枫生物碱类化合物。
24、优选地，步骤(1)中，所述乙醇为体积分数90％～95％的乙醇水溶液。
25、优选地，步骤(2)中，所述调节水溶液ph为采用3％酒石酸及盐酸调节至ph＝2～3。
26、优选地，步骤(3)中，所述调节水层ph为采用饱和碳酸钠溶液调节至ph＝9～10。
27、优选地，步骤(5)中，所述分离为先经过硅胶柱层析进行洗脱，然后再经过葡聚糖凝胶sephadex lh-20柱分离。
28、更优选地，所述硅胶柱层析进行洗脱的洗脱体系为体积比(80:1)–(1:1)的二氯甲烷和甲醇。
29、优选地，步骤(5)中，所述纯化为以反相c18柱经过半制备高效液相色谱纯化，流动相为甲醇和水。
30、优选地，所述甲醇和水的体积比为(100–10):(0–90)，所述流动相的流速为1～3ml/min。
31、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
32、为从天然产物中筛选出具有抗ev71活性的化合物，本专利技术从牛耳枫(daphniphyllum calycinum)枝叶中分离到四个新的牛耳枫生物碱类化合物，该类化合物结构新颖，其中化合物1–3的骨架为氰基取代的罕见多环骨架，化合物4为罕见的daphmanidin型生物碱。该类化合物具有肠道病毒71型抑制活性，尤其是化合物3、4，其中化合物3、4在ev71(moi＝0.1)感染48h后，化合物ec50分别为2.826μg/ml、3.783μg/ml。在相同感染条件下，化合物3、4的ec50均比利巴韦林小(ribavi本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.牛耳枫生物碱类化合物，其特征在于，所述牛耳枫生物碱类化合物包括化合物1–4中的至少一种，所述化合物1–4的结构式如下所示：
2.根据权利要求1所述的牛耳枫生物碱类化合物，其特征在于，所述牛耳枫生物碱类化合物包括化合物3、4中的至少一种，所述化合物3、4的结构式如下所示：
3.权利要求1或2所述的牛耳枫生物碱类化合物在制备抗EV71病毒药物或防治EV71病毒诱发的婴幼儿手足口病的药物中的应用。
4.一种抗EV71药物，其特征在于，所述抗EV71药物以化合物1–4中的至少一种作为活性成分，所述化合物1–4的结构式如下所示：
5.根据权利要求4所述的一种抗EV71药物，其特征在于，所述抗EV71药物以化合物3、4中的至少一种作为活性成分，所述化合物3、4的结构式如下所示：
6.根据权利要求4或5所述的一种抗EV71药物，其特征在于，所述抗EV71药物还包括药学上可接受的辅料。
7.根据权利要求4或5所述的一种抗EV71药物，其特征在于，所述抗EV71药物的剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊剂、滴丸剂、缓释剂、口服液制剂
8.根据权利要求4或5所述的一种抗EV71药物，其特征在于，所述抗EV71药物的给药方式包括口服、注射。
...【技术特征摘要】
1.牛耳枫生物碱类化合物，其特征在于，所述牛耳枫生物碱类化合物包括化合物1–4中的至少一种，所述化合物1–4的结构式如下所示：
2.根据权利要求1所述的牛耳枫生物碱类化合物，其特征在于，所述牛耳枫生物碱类化合物包括化合物3、4中的至少一种，所述化合物3、4的结构式如下所示：
3.权利要求1或2所述的牛耳枫生物碱类化合物在制备抗ev71病毒药物或防治ev71病毒诱发的婴幼儿手足口病的药物中的应用。
4.一种抗ev71药物，其特征在于，所述抗ev71药物以化合物1–4中的至少一种作为活性成分，所述化合物1–4的结构式如下所示：<...
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