【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体说涉及一种用于识别重组egf-crm197疫苗的单克隆抗体及其制备方法。
技术介绍
1、人表皮生长因子(epidermal growth factor，egf)是一种由53个氨基酸组成的单链低分子量多肽，主要分布于人体各种组织的细胞外液中。egf主要通过egfr发挥其功能，egf与egfr结合后，可激活包括ras-raf-mapk、jak-stat、pi(3)k-akt等在内的多条信号通路。近年来研究显示：在许多实质性肿瘤如神经胶质细胞瘤、乳腺癌肺癌、卵巢癌、头颈部磷癌、宫颈癌、食管癌、前列腺癌、肝癌、结肠癌、胃癌等中egf及egfr均有过度表达。多种肿瘤通过自分泌和旁分泌的方式产生大量egf，从而使egfr通路过度活化。过度活化的egfr通过多条传导信号通路，增强转录、转录后活动或基因表达，使细胞表型发生转化，进而导致肿瘤的发生、发展。因此，降低肿瘤细胞内egf的含量，对于抑制肿瘤细胞的增殖、肿瘤细胞间的信号传导，进而抑制肿瘤的发展具有举足轻重的作用。
2、重组egf-crm197肿瘤治疗性疫苗(以下简称“重组egf-crm197疫苗”)是一种egf与载体蛋白crm197交联而成的新型结合疫苗，由上海惠盾生物技术有限公司研发，，目前已完成ⅰ期临床试验，正在开展ⅱ期临床试验。该疫苗的主要机制是诱导患者体内产生高水平的抗egf抗体，中和体内的egf，从而抑制egf/egfr信号通路，进而抑制依赖该信号通路的肿瘤细胞的生长，达到治疗肿瘤的目的。
3、疫苗效价是重组egf-crm197疫
4、此外，在临床使用中，重组egf-crm197疫苗免疫后诱导产生的中和抗体，中和患者血清中的egf，从而发挥抗肿瘤效应，因此，血清中egf浓度的下调也是评价疫苗免疫效能的重要衡量指标，研发一种特异性识别重组egf-crm197的单克隆抗体，作为egf定量elisa检测试剂盒的捕获或检测抗体，可用于定量检测免疫重组egf-crm197疫苗的患者，血清中egf的浓度，进而评估重组egf-crm197疫苗的有效性，为患者加强免疫提供依据。
5、综上所述，研发一种识别重组egf-crm197疫苗的单克隆抗体，可用于检测重组egf-crm197疫苗的体外相对效力，为重组egf-crm197临床使用前进行质量控制提供了一种有力的手段；此外，一种识别重组egf-crm197疫苗的单克隆抗体，可用于人egf定量elisa检测试剂盒的制备。因此，伴随重组egf-crm197疫苗的开发及临床应用，研发一种识别重组egf-crm197疫苗的单克隆抗体具有重要意义。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足及实际的需求，本专利技术提供了一种识别重组egf-crm197疫苗的单克隆抗体及其应用，所述单克隆抗体能够结合重组egf-crm197疫苗，在评价重组egf-crm197相对效价，以及临床应用中评价疫苗免疫效能方面发挥了重要作用。
2、为达到此目的，本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面：本专利技术提供一种识别重组egf-crm197疫苗的单克隆抗体，
4、所述抗体的重链可变区具有如下的互补决定区cdr：
5、seq id no:2的vh-cdr1、seq id no:3的vh-cdr2，和seq id no:4的vh-cdr3；
6、所述抗体的轻链可变区具有如下互补决定区cdr：
7、seq id no:10的vl-cdr1、seq id no:11的vl-cdr2和seq id no:12的vl-cdr3；
8、进一步的，所述抗体重链可变区的氨基酸序列为seq id no:1。
9、进一步的，所述抗体轻链可变区的氨基酸序列为seq id no:9。
10、进一步的，所述单克隆抗体用于制备评估重组egf-crm197疫苗体外相对效力的试剂盒和定量检测血清中egf浓度的elisa试剂盒。
11、本专利技术还提供了一种制备单克隆抗体的方法，包括如下步骤：
12、步骤1：动物免疫：采用6周龄的balb/c小鼠，抗原为重组egf-crm197疫苗。免疫途径为皮下注射；每周给药1次，共给药4次。
13、步骤2：细胞融合：将步骤(1)中优选出的小鼠，制备脾细胞悬液。取其脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞开始融合，采用peg介导的融合法进行融合。
14、步骤3：杂交瘤细胞的筛选：扩增步骤(2)中的杂交瘤细胞，取上清检测elisa效价及抗体亚型，选取针对egf抗原呈阳性的细胞进行克隆。为保证杂交瘤细胞株的阳性率和稳定地产生抗体，进行3-4次克隆，选取3-4次筛选均为100％阳性的克隆。
15、步骤4：杂交瘤细胞的克隆化：将步骤(3)筛选出的阳性孔用常规的有限稀释法克隆，筛选产生抗egf特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株，编号为s-172-4细胞；
16、步骤5：单克隆抗体的制备：裸鼠腹腔提前一周注射液体石蜡0.5ml，将步骤(4)得到的s-172-4细胞用生理盐水调整至5×106/ml，腹腔注射200μl，7-10天后，收集小鼠腹水。腹水通过proteina层析柱纯化，先用a液pb ph7.0平衡层析柱，腹水样品上柱后，采用b液0.1m甘氨酸-hcl ph2.7，线性洗脱，直至出现抗体的峰型，最终用1m ph 8.0tris-hcl将纯化后的抗体ph调节至7.2，过膜除菌，获得s-172-4单克隆抗体。
17、与现有技术相比，本专利技术的优势之处在于：本专利技术提供的单克隆抗体能够特异性、高亲和力的识别重组egf-crm197疫苗组分egf，用于可用于检测重组egf-crm197疫苗的体外相对效力，准确性高，重复性好，为重组egf-crm197临床使用前进行质量控制提供了一种有效手段。此外，在临床使用中，重组egf-crm197疫苗免疫后诱导产生的中和抗体，中和患者血清中的egf，从而发挥抗肿瘤效应，因此，血清中egf浓度的下调也是评价疫苗免疫效能的重要衡量指标。本专利技术提供的一种特异性识别重组egf-crm197的单克隆抗体，可作为egf定量elisa检测试剂盒的捕获或检测抗体，用于制备egf定量elisa检测试剂盒，灵敏度高，重复性好，可准确检测免疫重组egf-crm197疫苗的患者血清中egf的浓度变化，进而评估重组egf-crm197疫苗的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种识别重组EGF-CRM197疫苗的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区具有如下的互补决定区CDR：
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体重链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO:1。
3.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQ IDNO:9。
4.一种识别重组EGF-CRM197疫苗的单克隆抗体的制备方法，制备如权利要求1-3中任意一项所述识别重组EGF-CRM197疫苗的单克隆抗体，其特征在于，包括以下步骤：
5.根据权利要求1所述识别重组EGF-CRM197疫苗的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体用于制备评估重组EGF-CRM197疫苗体外相对效力的试剂盒和定量检测血清中EGF浓度的ELISA试剂盒。
【技术特征摘要】
1.一种识别重组egf-crm197疫苗的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的重链可变区具有如下的互补决定区cdr：
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体重链可变区的氨基酸序列为seq idno:1。
3.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体轻链可变区的氨基酸序列为seq idno:9。
4.一种识别重组eg...
【专利技术属性】
技术研发人员：万涛，吁亭，范季瀛，
申请(专利权)人：上海惠盾因泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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