【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于海洋生物，具体地说是一种大黄鱼精巢冷冻保存的方法。
技术介绍
1、大黄鱼是我国重要的海洋经济鱼类，主要分布在南海、东海和黄海南部，其体色金黄、肉质鲜美，深受消费者的喜爱，素有“国鱼”之美誉。上世纪70年代，大黄鱼海上年均捕捞量高达12万吨，位居我国四大传统的主捕对象之首。然而，由于过度捕捞，尤其是越冬场大围捕，导致大黄鱼种质资源日渐匮乏，濒临枯竭。目前野生大黄鱼保护的现状仍然令人堪忧，已被列入《世界自然保护联盟濒危物种红色名录》(iucn version 2024-2)，濒危等级为极危(cr)。
2、鱼类生殖细胞移植技术又称“借腹生子”或“借腹怀胎”技术，把生殖干细胞移植到同种或异种受体中，供体细胞然后在受体内定居、分化和成熟，最终产生供体来源的配子。与鱼类生殖细胞冷冻保存技术相结合，通过移植冷冻保存的精原干细胞，为珍贵、濒危、优质种质资源的保存、遗传改良以及高效开发利用开辟新途径。
3、由于精巢支撑结构的保护作用，通过保存鱼类精巢来分离精原干细胞比单独保存干细胞成活率更高。目前，对鱼类精巢冷冻保存多采用二甲基亚砜(dmso)、1,2-丙二醇(pg)、胎牛血清(fbs)、海藻糖、蛋黄粉等渗透性或非渗透性抗冻剂，借助程序降温仪进行梯度降温，这样大大增加了保存的成本，且不适合野外及无设备实验室及时保存种质资源。有些渗透性抗冻剂如dmso还存在毒性大问题。为此，筛选一组价格低廉、绿色环保、无毒副作用的抗冻剂，寻找操作简单、成本节约的保存方法尤为重要。本专利技术以明胶和变性淀粉作为抗冻剂，液氮直接冻
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种使用明胶和变性淀粉冷冻保存大黄鱼精巢的方法。
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技术实现思路
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4、本专利技术的第一目的在于提供一种新的大黄鱼精巢抗冻剂，满足抗冻剂价格低廉、无毒副作用要求，保证大黄鱼精巢冷冻保存后生殖细胞具有较高存活率。
5、本专利技术的第二目的在于提供一种简单的精巢冷冻保存程序，在所述抗冻剂保护下，可以直接液氮冻存，无需借助程序降温仪。
6、为实现上述目的，本专利技术所采取的技术方案是：
7、一种使用明胶和变性淀粉冷冻保存大黄鱼精巢的方法，将性成熟大黄鱼精巢取出，切成适合组织块，加入抗冻剂，在抗冻剂保护下，借助液氮通过简单冷冻程序进行保存，使用时进行水浴复苏。
8、所述鱼的精巢组织块，要求取自性成熟大黄鱼，置于l-15培养基中，切成长：宽：高大为1cm:1cm:0.5cm。
9、所述抗冻剂由3％(wt/vol)明胶和4％(wt/vol)变性淀粉组成，使用hanks缓冲液配置。
10、所述冷冻程序为将组织块放入2ml冻存管，加入1-1.5ml抗冻剂，于冰上平衡60min，结束后转入液氮罐提桶，移至液氮表面停留10min，再投入液氮冻存。
11、所述水浴复苏温度为10℃，解冻时间为8min，之后转入l-15培养基中浸泡洗去抗冻剂，将精巢剪碎、酶解，0.4％台盼蓝据染色检测细胞活力。
12、本专利技术具有如下优点：
13、本专利技术利用抗冻剂明胶和变性淀粉，通过液氮对大黄鱼精巢进行冷冻保存，复苏后检测到组织内较高的细胞存活率，其操作简单，节约成本，方便携带，方法有效，可用于保存经济鱼类种质资源。具体为：
14、1.操作简单，本专利技术实际操作中只需将取出的适当精巢组织加入抗冻剂，投入液氮冻存，即可达到良好的保存效果。
15、2.节约成本，本专利技术采用抗冻剂明胶和变性淀粉价格低廉，且冷冻程序为直接液氮冻存，无需操纵程序降温仪进行降温，节约了耗材、仪器成本，同时节约劳动力。
16、3.方便携带，本专利技术也可以在实验室之外如养殖场、鱼类自然保护区、野外等地进行种质资源保存，只需用便携式液氮罐装取少量液氮，并带所用试剂、解剖工具即可。
17、4.绿色环保，本专利技术所使用的抗冻剂由明胶和变性淀粉组成，对人体、环境无危害，符合环境友好型社会建设要求。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种使用明胶和变性淀粉冷冻保存大黄鱼精巢的方法，其特征在于：将鱼精巢取出，加入抗冻剂，投入液氮冻存，使用时进行水浴复苏。
2.根据权利要求1所述的一种使用明胶和变性淀粉冷冻保存大黄鱼精巢的方法，其特征在于：将鱼的精巢组织取出，置于L-15培养基中，切成长：宽：高大为1cm:1cm:0.5cm的组织块，之后放入2mL冻存管，加入1-1.5mL抗冻剂覆盖组织块，于冰上平衡60min，最后投入液氮冻存。
3.根据权利要求2所述的一种使用明胶和变性淀粉冷冻保存大黄鱼精巢的方法，其特征在于：所述抗冻剂由3％(wt/vol)明胶和4％(wt/vol)变性淀粉组成，使用Hanks缓冲液配置。
4.根据权利要求2所述的一种使用明胶和变性淀粉冷冻保存大黄鱼精巢的方法，其特征在于：所述冷冻程序为冰上平衡结束后转入液氮罐提桶，移至液氮表面停留10min，再投入液氮冻存，根据后续需要进行水浴复苏。
5.根据权利要求4所述的一种使用明胶和变性淀粉冷冻保存大黄鱼精巢的方法，其特征在于：所述水浴复苏温度为10℃，解冻时间为8min，之后转入L-15培养基中浸
...【技术特征摘要】
1.一种使用明胶和变性淀粉冷冻保存大黄鱼精巢的方法，其特征在于：将鱼精巢取出，加入抗冻剂，投入液氮冻存，使用时进行水浴复苏。
2.根据权利要求1所述的一种使用明胶和变性淀粉冷冻保存大黄鱼精巢的方法，其特征在于：将鱼的精巢组织取出，置于l-15培养基中，切成长：宽：高大为1cm:1cm:0.5cm的组织块，之后放入2ml冻存管，加入1-1.5ml抗冻剂覆盖组织块，于冰上平衡60min，最后投入液氮冻存。
3.根据权利要求2所述的一种使用明胶和变性淀粉冷冻保存大黄鱼精巢的方法，其特征在于：所述抗冻剂由3％...
【专利技术属性】
技术研发人员：周莉，韩坤煌，孙赵韩，陈佳，江孝泉，李菲艳，陈嘉仪，
申请(专利权)人：宁德师范学院，
类型：发明
国别省市：
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