【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于腺病毒，尤其涉及一种通用型亲和整体柱的制备方法。
技术介绍
1、腺相关病毒被认为是一种极具潜力的基因治疗运载工具，具有安全稳定、宿主范围广，可在宿主细胞内长期表达等优点。目前，从已有的临床前研究数据获悉，aav载体已成功实现在人体器官中安全、高效、长期的基因表达，能够实现长期治疗的目的。随着aav基因药物的上市，aav的临床研究逐渐增加，大规模纯化成为其亟待解决的问题。目前，商业用于aav纯化的亲和树脂包括六种吸附剂，如porostmcaptureselecttmaavx、aav8(csal8)和aav9(csal9)、avbsepharosehp、captoavb和avipure，它们均依赖于从动物免疫或生物展示文库中衍生的单链羊驼抗体片段。这些配体提供了所需的高结合强度和选择性，以从当前的低产品滴度和大量杂质的原料中分离aav。然而，这些配体需要使用苛刻的水性缓冲液(ph≤3)来释放结合的衣壳，并限制了树脂的重复使用，同时由于其生化稳定性有限，导致了高昂的成本，为此我们提出一种通用型亲和整体柱的制备方法。
技术实现思路
1、本专利技术提供一种通用型亲和整体柱的制备方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种通用型亲和整体柱的制备方法，包括以下步骤：
3、s1、首先建立纳米抗体文库构建免疫库，使用羊驼免疫，采取静脉血100ml，分别筛选出对aav8和aav9具有高亲和力的纳米抗体，随后对菌株进行
4、s2、对1.25ml整体柱进行制作；
5、s3、将步骤s2中支撑的整体柱进行活化，接着将活化的整体柱与步骤s1中得到的aav8纳米抗体和aav9纳米抗体相互偶联，使得整体柱与纳米抗体相互偶联；
6、s4、对aav病毒进行获取；
7、s5、将步骤s3中整体柱与纳米抗体相互偶联材料与s4中获取的aav病毒相互结合，从而计算aav结合量和回收率数。
8、进一步的，所述步骤s1中具体步骤为：
9、纳米抗体文库构建免疫库：使用羊驼免疫4次，采取静脉血100ml，分离淋巴细胞提取mrna，mrna经逆转录和巢式pcr后，进行克隆，从而克隆得到phagemid中的质粒库，随后转化tg1，扩增和纯化噬菌体文库。
10、纳米抗体筛选：将抗原加入到pbs中，并且将加入有pbs的抗原加入到免疫管中，在4℃中进行孵育；随后将适量扩增的噬菌体加入到1％bsa中，室温旋转孵育2h，同时往抱被好的免疫管中加入1％bsa，室温旋转孵育2h；将封闭过后的免疫管用含有图文的pbs洗3次，每次5min，将封闭后的噬菌体文库加入封闭后的免疫管中，室温旋转孵育1h；将抗原和噬菌体孵育后的免疫管使用含有0.1％吐温的pbs进行清洗；往免疫管中加入0.1mtrimethymime，室温孵育10min，随后加入1mtris-hcl中和trimethymime，将洗脱噬菌体转移到新的离心管中，将洗脱的噬菌体按照扩增和纯化噬菌体文库，扩增后在重复筛选过程2次；洗脱的噬菌体进行测序，得到与抗原结合的候选纳米抗体dna序列库；将初筛得到的噬菌体库进行elisa鉴定，测序得到纳米抗体。
11、菌株构建：将上述步骤筛选获得的序列委外构建质粒测序，将质粒转入大肠杆菌培养，获得菌株；
12、纳米抗体表达和纯化：使用tb培养基，按照5％接种量接种，37℃培养3～5h，加入诱导剂进行过夜诱导，将诱导液离心获得含有纳米抗体的湿菌，使用高压破碎机进行细胞破碎，高压破碎机在温度4℃，转速在10000rpm离心后取上清；使用0.1平板超滤膜过滤，然后经过prepack finedex 75pg16/600层析柱进行aav纳米抗体的分离纯化。
13、进一步的，所述步骤s2中具体步骤为；
14、配制液体：准备将甲基丙烯酸缩水甘油酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、环己醇、十二醇和过硫酸钠，并且将上述原料按照20:20:50:9:1进行混合，用超声波振荡进行溶解，取6ml，灌注在模具中，随后将灌有混合药剂的模具放入80℃水浴锅中反应24h，使其成型，成型完成后进行脱模；
15、整体柱修型：采用特殊刀具将上述整体柱修整为1.25ml的柱状整体柱，底部直径20mm，高4mm，放入特定的组件中，采用酒精洗涤制孔剂；
16、测试：测试压力流速及完整性。
17、进一步的，所述步骤s3中具体步骤为；
18、整体柱活化：将1g乙二胺用10g水溶解，溶解后将1.25ml柱子浸泡在乙二胺溶液中，并且将液体加热到70℃，同时将温度保持在70℃反应30h。
19、偶联：取0.02gsmcc(4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯)，溶解到ph7.0mes缓冲液中，将步骤s2中制备的整体柱，按照1ml/min打循环，并且循环时间2h，直至打空；
20、将aav8纳米抗体2mg溶解到5mlph7.0mes中，使用1ml/min流速循环2h，测试纳米抗体完全接上柱子，使用去离子水打循环将缓冲液清洗干净。
21、进一步的，所述步骤s4中具体步骤为；
22、培养：培养hek293t细胞12～24h，以hyclone高糖dmem为培养基，在转染前换为无血清培养基；
23、转染细胞：将配置好的转染体系分别缓慢滴加到培养皿中，缓慢摇晃培养皿以混匀，置于培养箱中培养；转染24h后换为无血清培养液。
24、病毒收集：病毒收集转染后48～72h可以收取病毒，将产毒的细胞连同培养基一起收集至离心管中，离心分离获取细胞沉淀，裂解细胞沉淀收取病毒。
25、进一步的，所述步骤s4中具体步骤为；
26、柱子：步骤s2中制备的1.25ml整体柱；
27、流速：2.5ml/min(cv)；
28、上样条件：10mm tris+300mm nacl ph8.0；
29、平衡缓冲液：10mm tris+300mm nacl ph8.0；
30、洗脱缓冲液：100mm hac+500mm nacl ph3.0。
31、本专利技术的有益效果是：
32、1、aav亲和填料可以减少aav纯化中的tff单元操作，可以大幅缩短时间并提高病毒回收率。
33、2、整体柱减少纳米抗体使用量达到大孔微球相同的结合载量。
34、3、对aav8和aav9兼具高亲和力，实现aav层析材料的通用性。
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1.一种通用型亲和整体柱的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种通用型亲和整体柱的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中具体步骤为：
3.根据权利要求1所述的一种通用型亲和整体柱的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中具体步骤为；
4.根据权利要求1所述的一种通用型亲和整体柱的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中具体步骤为；
5.根据权利要求1所述的一种通用型亲和整体柱的制备方法，其特征在于：所述步骤S4中具体步骤为；
6.根据权利要求1所述的一种通用型亲和整体柱的制备方法，其特征在于：所述步骤S4中具体步骤为；
【技术特征摘要】
1.一种通用型亲和整体柱的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种通用型亲和整体柱的制备方法，其特征在于：所述步骤s1中具体步骤为：
3.根据权利要求1所述的一种通用型亲和整体柱的制备方法，其特征在于：所述步骤s2中具体步骤为；
4.根据权...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈晓凌，
申请(专利权)人：无锡萃纯生物材料科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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