【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医学分子生物学领域，具体地涉及靶向人tlr4基因sirna表达载体的构建、筛选及其在抑制乳腺癌细胞中tlr4基因表达水平中的应用。尤其涉及利用sirna通过rna干扰途径特异性抑制tlr4基因表达及其在杀伤乳腺癌细胞，抑制细胞转移方面的用途。
技术介绍
1、乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，全世界每年约有130万妇女发生乳腺癌，有50万妇女死于乳腺癌。其发病率始终处于上升状态，尤以近20年来最为显著。乳腺癌的发生涉及细胞凋亡与增殖失衡、细胞的分化紊乱、癌基因与抑癌基因的功能失调以及相关信号传导系统等多种生命活动的异常。随着现代分子生物学、分子免疫学、肿瘤免疫学、生物工程学研究的迅速进展，人们对乳腺癌的研究已进入了一个活跃阶段。
2、目前乳腺癌的治疗主要是采取手术为主，辅以化疗、放疗及内分泌治疗等综合方式。近年来，随着肿瘤分子生物学研究的日趋深入，肿瘤的基因治疗以其治疗的高特异性和相对较低的毒副作用为乳腺癌的治疗开辟了一个新天地。因此，寻找可用于诊断和预后判断的生物标志物，并由此引出新的治疗靶点，是当今肿瘤学研究的重要内容。
3、基因治疗（gene therapy）是将正常的外源基因导入人体靶细胞或组织以取代有缺陷的基因，通过其正常表达，达到治疗基因病的目的。基因治疗作为治疗疾病的一种新手段，正愈来愈受到人们的重视和关注。目前基因治疗主要涉及恶性肿瘤、心脑血管疾病、遗传病和某些传染病，其中又以恶性肿瘤为主要治疗对象，它为肿瘤治疗开辟了一条新的道路，而且随着研究的深入，基因治疗可能成为从根本上解决
4、在正常生物体内，细胞内的双链rna（dsrna，38个碱基以上）在依赖atp的情况下，被核糖核酸酶dicer切割成双链小干扰rna（sirna， 21～25个碱基）。sirna这个结构对基因沉默效应十分关键。（1）sirna中有两条链，一条为正义链，一条为反义链，其中反义链可和多种核酸酶结合形成沉默复合物（risc），同时由于反义链与某一种mrna的编码区是同源的，因此可与此编码区互补结合，随之引导risc结合mrna，然后通过依赖于atp的解螺旋酶解开sirna的双链，并将其正义链与靶mrna置换，即mrna取代正义链与反义链互补，继而核酸酶将mrna切割成21～23 nt的小片段，切断部位大约在与sirna反义链配对序列的中部，于是mrna发生降解，从而导致基因表达的沉默，干扰了靶基因的表达。（2）risc中的rdrp（rna依赖性rna聚合酶） 以sirna反义链作为引物，以靶mrna为模板合成新的dsrna，然后由dicer切割产生新的sirna，新sirna再去识别新一组mrna，又产生新的sirna。经过若干次合成-切割循环，沉默信号就会不断放大，甚至穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持。
5、rnai具有许多传统方法无法比拟的特点和优势。rnai具有以下特征: （1）抗干扰性：rnai是 dsrna介导的 ptgs机制，翻译抑制剂对rnai不产生影响;（2）特异性：rnai具有很高的特异性，rnai只能特异地降解与之序列相应的单个内源基因的mrna，而其它mrna的表达则不受影响；（3）催化性：rnai抑制基因表达具有很高的效率，是以催化放大的方式进行的，相对少量的 dsrna分子就能完全抑制相应基因的表达；（4）传递性：rnai抑制基因表达的效应可以跨越细胞界限，在不同细胞甚至生物体间长距离传递和维持，并可传递给子代；（5）长度限制性：引发有效 rnai的 dsrna不得短于 21 bp，而大于30 bp的dsrna诱导的不是特异的 rnai，而是引起细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡，一般来说，引发有效rnai的 dsrna要求在 21～23 bp；（6）浓度、时间双重依赖性：dsrna诱发的 rnai效应的强度随着其浓度的增高而增强；（7）atp依赖性：在去除 atp的样品中，rnai现象降低或消失，显示 rnai是一个 atp依赖的过程，可能 dicer和 risc的酶切反应必须由 atp提供能量所致。基于以上的特点，sirna作用远远优于反义寡核苷酸、核酶等，rnai可有效的弥补反义寡核苷酸技术与基因敲除技术的不足。
6、rna干扰作为一种转录后基因沉默（post transcriptional gene silencing ，ptgs）机制，与传统的基因敲除等基因沉默技术相比，rnai技术具有投入少，操作简便等优势。因此，人们把注意力从反义 rna技术如核酶、寡聚脱氧核苷酸等转移至 rnai上，使其在基因功能研究以及基因治疗中发挥了重要的作用。从 1998年 fire首次报道双链rna可以特异性地沉默基因表达以来，rnai已经在各个领域广泛应用，尤其在肿瘤的治疗领域中，已显示巨大的潜力。近年来rnai成功用于构建转基因动物模型的报道日益增多，标志着rnai技术将成为研究基因功能及进行基因治疗不可缺少的方法。rnai技术的不断成熟使其在医学领域得到快速的发展，尤其在癌症治疗方面，rnai作为一种基因治疗手段已显示出远大的前景，并有望在肿瘤基因治疗、遗传性疾病以及病毒性感染治疗等方面发挥重要作用。
7、toll 样受体家族（tlr）属于机体固有免疫系统中的模式识别受体。在体内发挥对病原相关分子模式和损伤相关分子模式的识别，通过下游信号诱导机体启动固有免疫，做出免疫应答。1997 年，janeway等在哺乳动物中发现了第一个tlr:tlr4。截至目前共发现了11种人tlr，广泛分布于各种组织，其中tlr4的研究最为广泛，不仅介导机体炎症反应，也与肿瘤的发生发展密切相关。
8、tlr4为单次跨膜蛋白，胞外区由富含亮氨酸的重复序列组成马蹄形结构域，起识别配体的作用。跨膜区为富含本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种抑制TLR4基因表达的siRNA，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的siRNA，其特征在于该siRNA是通过如SEQ ID NO：7所示的DNA寡核苷酸链转录并在细胞内由核酸酶Dicer剪切而成。
3.权利要求1所述的siRNA在制备抑制癌细胞增殖和转移相关药物中的应用。
4.根据权利要求3所述siRNA在制备抑制癌细胞增殖和转移相关药物中的应用，其特征在于：所述癌细胞为乳腺癌细胞MDA-MB-231和HCC1806细胞株。
【技术特征摘要】
1.一种抑制tlr4基因表达的sirna，其特征在于：其核苷酸序列如seq id no：1所示。
2.根据权利要求1所述的sirna，其特征在于该sirna是通过如seq id no：7所示的dna寡核苷酸链转录并在细胞内由核酸酶dicer剪切而成...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵玺龙，冯强，江亚，刘奕君，杨俊春，郑士奇，张华清，陈桂芳，
申请(专利权)人：中国人民解放军联勤保障部队第九二〇医院，
类型：发明
国别省市：
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