【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶固定化，特别是涉及一种配体偶联固定化脂肪酶的方法。
技术介绍
1、酶可以催化许多非天然反应，这种现象被称作“酶催化非专一性”，这一发现极大地扩展了酶在有机合成中的应用。血红素蛋白是一类含有铁卟啉的蛋白质（血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素、过氧化物酶等），具有催化多种非天然反应的能力，如氧化反应、卡宾转移反应和卡宾x-h插入反应。这些研究开辟了由血红素蛋白催化的有机反应类型的新世界。中国专利201910954938.x公开了一种双蛋白催化级联反应合成喹喔啉类化合物的方法，通过将血红素类蛋白催化卡宾类反应与脂肪酶类蛋白催化反应偶联在一起，构建了一个双蛋白一锅出法合成喹喔啉类化合物的绿色方法，与传统的分步合成方法相比，只需一步串联即可完成，可将原料投入一个反应体系中即可完成两步催化并得到最终产物。但该方法还存在游离血红素类蛋白和脂肪酶类蛋白在溶剂中难以回收利用、在反应中活性低等问题。
技术实现思路
1、为了进一步提高血红素类蛋白和脂肪酶类蛋白的催化效果和可回收利用性，本申请提供一种配体偶联固定化脂肪酶的方法。
2、第一方面，本申请提供一种配体偶联固定化脂肪酶的方法，采用如下的技术方案：
3、一种配体偶联固定化脂肪酶的方法，包括以下步骤：包括以下步骤：s1，先将均苯三甲酸溶于甲醇，得混合液a；s2，将七水合硫酸钴溶于甲醇，然后加入辣根过氧化物酶（hrp），混合均匀，得混合液b；s3，将混合液a和混合液b混合均匀，于38-45℃下搅拌15-20h，第一次离
4、采用上述技术方案，以七水合硫酸钴为软模版和合成钴基金属有机骨架（co-mof）的金属盐前体物，通过将七水合硫酸钴溶解在适量的甲醇中，形成胶体凝聚小球，然后通过与均苯三甲酸配位反应，并通过水相溶解软模版，进行造孔，获得具有密集壳层和疏松核芯的壳核式结构的介孔钴基金属有机骨架载体（me-co-mof），并通过将辣根过氧化物酶在me-co-mof制备中包覆，实现对辣根过氧化物酶的固定，再通过共价连接法实现对南极假丝酵母脂肪酶的固定，最终制备出能够促进喹喔啉类化合物高效合成的配体偶联固定化脂肪酶。
5、优选的，所述s1中均苯三甲酸和甲醇的用量比为（0.5-0.8）mmol:（15-20）ml。
6、通过采用上述技术方案，合适的甲醇添加量可以使七水合硫酸钴在甲醇形成胶体凝聚小球。
7、优选的，所述s2中七水合硫酸钴、甲醇和辣根过氧化物酶的用量比为（0.7-1.0）mmol:（12-18）ml:（12-14）mg。
8、通过采用上述技术方案，将辣根过氧化物酶在me-co-mof形成过程中添加，能够实现对辣根过氧化物酶的包覆。
9、优选的，所述s3中混合液a和混合液b的用量比为（18-22）ml:（15-20）ml。
10、优选的，所述s3中第一次离心速度为6500-7200r/min，第二次离心速度为6000-6800r/min。
11、通过采用上述技术方案，在该比例下所制备的me-co-mof对辣根过氧化物酶的包覆程度以及辣根过氧化物酶的活性最佳。
12、优选的，所述s4中hrp@me-co-mof、2-吗啉乙磺酸缓冲液、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺、n-羟基琥珀酰亚胺、南极假丝酵母脂肪酶的用量比为（35-62）mg:（8-10）ml:（28-35）mg:（23-30）mg:（8-10）mg。
13、优选的，所述s4中2-吗啉乙磺酸缓冲液的ph值为5.5-6.5。
14、优选的，所述s4中离心速度为6300-7000r/min。
15、通过采用上述技术方案，以1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺为激活羧基剂，与南极假丝酵母脂肪酶上的氨基共价附着，从而将南极假丝酵母脂肪酶固定于hrp@me-co-mof上。
16、第二方面，本申请提供一种配体偶联固定化脂肪酶，采用上述制备方法制备得到。
17、第三方面，本申请提供一种配体偶联固定化脂肪酶的应用，将所述配体偶联固定化脂肪酶应用于合成喹喔啉类化合物。
18、综上所述，本申请具有以下有益效果：
19、1、本申请采用通过将七水合硫酸钴溶解在适量的甲醇溶液，形成胶体凝聚小球，然后通过与均苯三甲酸配位反应，并通过水相溶解造孔，获得密集壳层和疏松核芯的壳核式结构的me-co-mof载体，并通过将辣根过氧化物酶在me-co-mof制备中包覆和共价连接法实现对南极假丝酵母脂肪酶的固定，最终制备出能够促进喹喔啉类化合物高效合成的配体偶联固定化脂肪酶。
20、2、本申请中通过制备具有介孔结构的高活性的配体偶联固定化脂肪酶，解决了喹喔啉类化合物合成中使用酶作催化剂出现的传质问题，提高了反应效率。
21、3、采用本申请制得的配体偶联固定化脂肪酶催化喹喔啉类化合物合成的反应中具有反应活性高，反应速度快，固定率高，可重复利用的特点。
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1.一种配体偶联固定化脂肪酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，先将均苯三甲酸溶于甲醇，得混合液A；S2，将七水合硫酸钴溶于甲醇，然后加入辣根过氧化物酶，混合均匀，得混合液B；S3，将混合液A和混合液B混合均匀，于38-45℃下搅拌15-20h，第一次离心，将沉淀转移水相静置20-30min，第二次离心，去离子水洗涤，得HRP@Me-Co-MOF；S4，将HRP@Me-Co-MOF悬浮至2-吗啉乙磺酸缓冲液，加入1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺，搅拌40-60min，然后加入N-羟基琥珀酰亚胺，继续搅拌50-70min，加入南极假丝酵母脂肪酶，继续反应10-12h，然后离心，收集沉淀，去离子水冲洗，冷冻干燥，得配体偶联固定化脂肪酶。
2.根据权利要求1所述的一种配体偶联固定化脂肪酶的方法，其特征在于，所述S1中均苯三甲酸和甲醇的用量比为（0.5-0.8）mmol:（15-20）mL。
3.根据权利要求1所述的一种配体偶联固定化脂肪酶的方法，其特征在于，所述S2中七水合硫酸钴、甲醇和辣根过氧化物酶的用量比为（0.7-1.0）mmol:（12-1
4.根据权利要求1所述的一种配体偶联固定化脂肪酶的方法，其特征在于，所述S3中混合液A和混合液B的用量比为（18-22）mL:（15-20）mL。
5.根据权利要求1所述的一种配体偶联固定化脂肪酶的方法，其特征在于，所述S3中第一次离心速度为6500-7200r/min，第二次离心速度为6000-6800r/min。
6.根据权利要求1所述的一种配体偶联固定化脂肪酶的方法，其特征在于，所述S4中HRP@Me-Co-MOF、2-吗啉乙磺酸缓冲液、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、南极假丝酵母脂肪酶的用量比为（35-62）mg:（8-10）mL:（28-35）mg:（23-30）mg:（8-10）mg。
7.根据权利要求1所述的一种配体偶联固定化脂肪酶的方法，其特征在于，所述S4中2-吗啉乙磺酸缓冲液的pH值为5.5-6.5。
8.根据权利要求1所述的一种配体偶联固定化脂肪酶的方法，其特征在于，所述S4中离心速度为6300-7000r/min。
9.一种配体偶联固定化脂肪酶，其特征在于，采用权利要求1-8任一所述的一种配体偶联固定化脂肪酶的方法制备得到。
10.一种配体偶联固定化脂肪酶的应用，其特征在于，所述配体偶联固定化脂肪酶用于应合成喹喔啉类化合物。
...【技术特征摘要】
1.一种配体偶联固定化脂肪酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：s1，先将均苯三甲酸溶于甲醇，得混合液a；s2，将七水合硫酸钴溶于甲醇，然后加入辣根过氧化物酶，混合均匀，得混合液b；s3，将混合液a和混合液b混合均匀，于38-45℃下搅拌15-20h，第一次离心，将沉淀转移水相静置20-30min，第二次离心，去离子水洗涤，得hrp@me-co-mof；s4，将hrp@me-co-mof悬浮至2-吗啉乙磺酸缓冲液，加入1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺，搅拌40-60min，然后加入n-羟基琥珀酰亚胺，继续搅拌50-70min，加入南极假丝酵母脂肪酶，继续反应10-12h，然后离心，收集沉淀，去离子水冲洗，冷冻干燥，得配体偶联固定化脂肪酶。
2.根据权利要求1所述的一种配体偶联固定化脂肪酶的方法，其特征在于，所述s1中均苯三甲酸和甲醇的用量比为（0.5-0.8）mmol:（15-20）ml。
3.根据权利要求1所述的一种配体偶联固定化脂肪酶的方法，其特征在于，所述s2中七水合硫酸钴、甲醇和辣根过氧化物酶的用量比为（0.7-1.0）mmol:（12-18）ml:（12-14）mg。
4.根据权利要求1所述的一种配体偶联固定化脂肪酶的方法，其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员：程煌裕，肖翔，管安奇，章森航，
申请(专利权)人：宁波大红鹰生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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