【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药，具体涉及bac-to-bac杆状病毒表达系统及其在制备重组腺相关病毒中的应用。
技术介绍
1、重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus，raav)，具有安全性高、免疫原性低、宿主范围广、能介导外源基因在动物体内长期稳定表达等特点，在基础研究和基因治疗领域都具有重要的应用。aav属于微小病毒科依赖病毒属，基因组大小约为4.7kb，主要包括分布在基因组两端的两个约145bp的反向末端重复序列(inverted terminalrepeats，itr)以及中间的rep基因和cap基因。aav感染细胞后不能单独复制，只有在辅助病毒(如腺病毒等)存在的情况下才能参与复制。将aav基因组中的rep基因和cap基因去掉并插入外源基因，同时利用反向补偿rep基因、cap基因和辅助病毒元件，最终可在细胞系中包装出携带外源基因的重组aav病毒颗粒(raav)。
2、基于杆状病毒表达载体(baculovirus expression vector，bev)介导的bac系统制备raav是目前主要的raav制备方法之一。bac系统根据感染昆虫细胞的杆状病毒数量可分为三杆状病毒系统(threebac)、二杆状病毒系统(twobac)和一杆状病毒系统(onebac)。onebac系统生产raav的流程为将搭载aav的cap基因表达框、aav的rep基因表达框和itr核心表达元件的供体质粒导入dh10 bac细菌(含有杆状病毒基因组bacmid和表达tn7转座酶的辅助质粒(pmon
3、目前在onebac系统中，携带aav包装元件的供体质粒(donor)和杆状病毒基因组(bacmid)在辅助质粒(pmon7124)的帮助下完成重组获得包含外源基因表达框的重组杆粒，再将重组杆粒转染昆虫细胞以拯救出有感染性的bev，并利用bev感染昆虫细胞你来制备raav。在这过程中，辅助质粒和供体质粒分别通过提供转座酶和供体dna片段来发挥作用，重组后此二质粒即变为无效质粒。但基于上述方法制备的重组杆粒为包含无效质粒的混合杆粒，转染效率不高，且易在细胞中发生重组，最终影响raav的产量。
技术实现思路
1、针对现有onebac系统生产raav技术的以上缺陷或改进需求，本专利技术提供bac-to-bac杆状病毒表达系统及其在制备重组腺相关病毒中的应用。其目的在于，通过构建基于温度敏感元件的可控的供体质粒及辅助质粒，在完成tn7转座酶介导的重组后即可在细菌里自行丢失，从而提高抽提的重组杆粒的纯净度，增加转染效率和子代bev的得率，提高onebac系统生产raav的产量。
2、本专利技术具体技术方案如下：
3、本专利技术一方面提供一种bac-to-bac杆状病毒表达系统，其包括供体质粒和dh10bac感受态细菌；所述供体质粒包含温度敏感复制子控制元件、rep基因表达框、cap基因表达框和带有异源功能性基因片段的重组腺相关病毒核心表达元件itr-goi；所述dh10 bac感受态细菌包含杆状病毒基因组质粒bacmid和辅助质粒，所述辅助质粒包含温度敏感复制子控制元件及tn7转座酶表达框。
4、进一步地，所述温度敏感复制子控制元件选自温度敏感型rk2质粒，所述温度敏感型rk2质粒由rk2质粒的trfa蛋白序列突变获得，所述温度敏感复制子控制元件由温度敏感型rk2质粒的oriv和trfa基因表达框组成；
5、优选地，所述rk2质粒的trfa蛋白序列突变为235g、163c、171w、173k、203l、213s、230v、247c、254d、313l、316v、332f或374缺失突变；
6、优选地，所述温度敏感复制子控制元件的核苷酸序列如seq id no.1所示。
7、进一步地，所述供体质粒通过将pfast.bac.dual、pfastbactm 1或pfastbactm hta质粒中的puc ori替换为温度敏感复制子控制元件构建而成；
8、优选地，所述供体质粒通过将pfast.bac.dual质粒中的puc ori替换为温度敏感复制子控制元件构建而成；
9、所述辅助质粒通过将pmon7124质粒中的puc ori替换为温度敏感复制子控制元件构建而成。
10、进一步地，所述带有异源功能性基因片段的重组腺相关病毒核心表达元件itr-goi为itr与异源功能性基因片段构建而成；
11、优选地，所述异源功能性基因片段选自egfp、rfp、bfp中的一种。
12、进一步地，所述rep基因表达框、cap基因表达框和带有异源功能性基因片段的重组腺相关病毒核心表达元件itr-goi的结构为cap-itr(goi)-rep。
13、进一步地，所述rep基因表达框的启动子为ph启动子；所述cap基因表达框的启动子为p10启动子。
14、进一步地，所述rep基因、cap基因和itr选自aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12、aav13、aavdj、aav-retro、aav-php.eb、aav-php.pb、aav-cap-b10。
15、本专利技术还提供一种重组杆粒，其基于所述的bac-to-bac杆状病毒表达系统制备得到，具体为：将供体质粒转入dh10 bac感受态细菌中，30℃培养使供体质粒与bacmid质粒发生重组，后利用蓝白斑筛选和菌落pcr的方法分别挑取、鉴定重组子，鉴定为阳性的重组子随后在37℃、仅含有kan+抗生素的培养基条件下培养，使重组子细菌中的辅助质粒和未利用完全的供体质粒在细菌中主动丢失，抽提得到重组杆粒。
16、本专利技术还提供所述的bac-to-bac杆状病毒表达系统或所述的重组杆粒在制备重组腺相关病毒中的应用。
17、本专利技术还提供一种重组腺相关病毒的制备方法，包括步骤：
18、(1)将所述的重组杆粒转染昆虫细胞，获得子代bev；
19、(2)将子代bev感染昆虫细胞，纯化获得raav；
20、优选地，步骤(1)和步骤(2)中所述昆虫细胞为sf9、expisf9或hi-five；
21、优选地，步骤(1)和步骤(2)中所述昆虫细胞选自expisf9细胞；
22、优选地，步骤(1)所述的重组杆粒转染昆虫细胞通过贴壁转染或悬浮转染。
23、本专利技术的有益效果为：
24、与现有的onebac系统相比，基于本专利技术onebac rk2-ts系统制备的重组杆粒更纯净，不含无效质粒，具备更高的质粒转染效率、子代bev本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，其特征在于，其包括供体质粒和DH10 Bac感受态细菌；所述供体质粒包含温度敏感复制子控制元件、Rep基因表达框、Cap基因表达框和带有异源功能性基因片段的重组腺相关病毒核心表达元件ITR-GOI；所述DH10 Bac感受态细菌包含杆状病毒基因组质粒bacmid和辅助质粒，所述辅助质粒包含温度敏感复制子控制元件及Tn7转座酶表达框。
2.根据权利要求1所述的Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，其特征在于，所述温度敏感复制子控制元件选自温度敏感型RK2质粒，所述温度敏感型RK2质粒由RK2质粒的trfA蛋白序列突变获得，所述温度敏感复制子控制元件由温度敏感型RK2质粒的oriV和trfA基因表达框组成；
3.根据权利要求1所述的Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，其特征在于，所述供体质粒通过将pFast.Bac.Dual、pFastBacTM1或pFastBacTMHT A质粒中的pUC ori替换为温度敏感复制子控制元件构建而成；
4.根据权利要求1所述的Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，其
5.根据权利要求1所述的Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，其特征在于，所述Rep基因表达框、Cap基因表达框和带有异源功能性基因片段的重组腺相关病毒核心表达元件ITR-GOI的结构为Cap-ITR(GOI)-Rep。
6.根据权利要求1所述的Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，其特征在于，所述Rep基因表达框的启动子为PH启动子；所述Cap基因表达框的启动子为P10启动子。
7.根据权利要求1所述的Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，其特征在于，所述Rep基因、Cap基因和ITR选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAVDJ、AAV-retro、AAV-PHP.eB、AAV-PHP.pB、AAV-CAP-B10。
8.一种重组杆粒，其特征在于，基于权利要求1所述的Bac-to-Bac杆状病毒表达系统制备得到，具体为：将供体质粒转入DH10 Bac感受态细菌中，30℃培养使供体质粒与bacmid质粒发生重组，后利用蓝白斑筛选和菌落PCR的方法分别挑取、鉴定重组子，鉴定为阳性的重组子随后在37℃、仅含有Kan+抗生素的培养基条件下培养，使重组子细菌中的辅助质粒和未利用完全的供体质粒在细菌中主动丢失，抽提得到重组杆粒。
9.权利要求1所述的Bac-to-Bac杆状病毒表达系统或权利要求8所述的重组杆粒在制备重组腺相关病毒中的应用。
10.一种重组腺相关病毒的制备方法，其特征在于，包括步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种bac-to-bac杆状病毒表达系统，其特征在于，其包括供体质粒和dh10 bac感受态细菌；所述供体质粒包含温度敏感复制子控制元件、rep基因表达框、cap基因表达框和带有异源功能性基因片段的重组腺相关病毒核心表达元件itr-goi；所述dh10 bac感受态细菌包含杆状病毒基因组质粒bacmid和辅助质粒，所述辅助质粒包含温度敏感复制子控制元件及tn7转座酶表达框。
2.根据权利要求1所述的bac-to-bac杆状病毒表达系统，其特征在于，所述温度敏感复制子控制元件选自温度敏感型rk2质粒，所述温度敏感型rk2质粒由rk2质粒的trfa蛋白序列突变获得，所述温度敏感复制子控制元件由温度敏感型rk2质粒的oriv和trfa基因表达框组成；
3.根据权利要求1所述的bac-to-bac杆状病毒表达系统，其特征在于，所述供体质粒通过将pfast.bac.dual、pfastbactm1或pfastbactmht a质粒中的puc ori替换为温度敏感复制子控制元件构建而成；
4.根据权利要求1所述的bac-to-bac杆状病毒表达系统，其特征在于，所述带有异源功能性基因片段的重组腺相关病毒核心表达元件itr-goi为itr与异源功能性基因片段构建而成；
5.根据权利要求1所述的bac-to-bac杆状病毒表达系统，其特征在于，所述rep基因表达框、cap基因表达框和带有异源功能...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱续涛，文鹏杰，徐富强，王培培，齐玉祥，韩丹，陈鹏，
申请(专利权)人：中国科学院深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。