【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本文中所公开的主题总体上涉及使用以位点特异性靶向元件实现的可编程添加(programmable addition via site-specific targeting element，paste)来进行位点特异性遗传改造的系统、方法和组合物，其用于疾病的治疗和诊断。
技术介绍
1、已经广泛开发了使用crispr-cas(成簇的规则间隔的短回文重复-crispr相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-crisprassociated proteins)免疫的rna指导的dna靶向原理进行的基因组编辑，并且其已成为广泛多种应用的强大基因组编辑手段。crispr-cas系统的主要优点在于对可编程dna干扰的需求最低：内切核酸酶，例如cas9、cas12或任何可编程核酸酶，其由可定制的双rna结构指导。cas9是使用hnh核酸酶结构域来切割靶链的多结构域酶。crispr/cas9蛋白-rna复合物通过指导rna(guide rna)定位在靶标上，然后进行切割以产生dna双链断裂(dsdna断裂(dsdna break)，dsb)。在切割之后，dna修复机制被激活以修复经切割的链。修复机制通常是来自两种类型中的一者：非同源末端连接(non-homologous end joining，nhej)或同源重组(homologous recombination，hr)。一般而言，nhej主导修复，并且易于出错，产生随机插失(indel)(插入或缺失)，引起移
2、最近，已经开发了新的指导编辑器，例如经指导的先导编辑器(prime editor，pe)pe1、pe2、和pe3，例如liu，d.et al.，nature 2019，576，149-157。这些pe是与cas 9 h 840a切口酶(cas9n(h840a))融合的逆转录酶(reverse transcriptase，rt)，并且使用先导编辑指导rna(prime-editing guide rna，pegrna)实现基因组编辑。尽管有这些开发，但是可编程基因整合通常仍依赖于细胞途径或修复过程。
3、因此，需要更有效的用于基因编辑和递送的工具。
技术实现思路
1、本公开内容提供了使核酸位点特异性地整合到细胞基因组中的方法。该方法包括通过将以下引入到细胞中而在细胞基因组中的在期望位置处并入整合位点：与逆转录酶结构域连接的dna结合核酸酶，其中所述dna结合核酸酶含有切口酶活性；和指导rna(grna)，其包含与整合序列连接的引物结合序列，其中grna与dna结合核酸酶相互作用并靶向细胞基因组中的期望位置，其中dna结合核酸酶对细胞基因组的链进行切口，并且逆转录酶结构域将grna中的整合序列并入到切口位点中，从而在细胞基因组的期望位置处提供整合位点。该方法还包括通过将以下引入到细胞中而使核酸整合到细胞基因组中：包含核酸的dna或rna链，所述核酸与和整合位点互补或缔合的序列连接，以及整合酶，其中整合酶通过整合、重组或逆转录与整合位点互补或缔合的序列而在整合位点处将核酸并入到细胞基因组中，从而将核酸引入到细胞的细胞基因组中的期望位置中。
2、在一些实施方案中，grna可与被dna结合核酸酶切口的基因组链的互补细胞基因组链杂交。
3、在一些实施方案中，整合酶可作为肽或编码该肽的核酸引入。
4、在一些实施方案中，dna结合核酸酶可作为肽或编码该肽的核酸引入。
5、在一些实施方案中，包含核酸的dna或rna链可作为微环、质粒、mrna或线性dna引入到细胞中。
6、在一些实施方案中，包含核酸的dna或rna链可以为1000bp至10,000bp。
7、在一些实施方案中，包含核酸的dna或rna链可超过10,000bp。
8、在一些实施方案中，包含核酸的dna或rna链可小于1000bp。
9、在一些实施方案中，包含核酸的dna可作为微环引入到细胞中。
10、在一些实施方案中，微环不可以包含细菌来源的序列。
11、在一些实施方案中，dna结合核酸酶可以与逆转录酶结构域连接，并且整合酶可以通过接头连接。接头可以是可切割的。接头可以是不可切割的。接头可以被与逆转录酶连接的dna结合核酸酶的两个关联结合结构域替代。
12、在一些实施方案中，整合酶可选自
13、crc，dre，vika，bxb1，rdf，flp，r1，r2，r3，r4，r5，tp901-1，a118，mr11，tg1，wβ，bl3，spbc，k38，peaches，veracruz，rebcuca，theia，benedict，kssjeb，pattyp，doom，scowl，lockley，switzer，bob3，troube，abrogate，anglerfish，sarfire，skipole，conceptii，museum，severus，airmid，benedict，hinder，icleared，sheen，mundrea，bxz2，
14、由r2、l1、tol2 tc1、tc3、mariner(himar 1)、mariner(mos 1)和minos编码的逆转录转座酶、及其任何突变体。
15、在一些实施方案中，整合酶可以是bxb1或其突变体。
16、在一些实施方案中，整合位点可选自attb位点、attp位点、attl位点、attr位点、lox71位点、vox位点或frt位点。
17、在一些实施方案中，含有切口酶活性的dna结合核酸酶可选自cas9-d10a、cas9-h840a和cas12a/b切口酶。
18、在一些实施方案中，逆转录酶结构域可选自莫洛尼鼠白血病病毒(moloneymurine leukemia virus，m-mlv)逆转录酶结构域、转录异种聚合酶(transcriptionxenopolymerase，rtx)、禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶(avian myeloblastosis virusreverse transcriptase，amv-rt)和直肠真杆菌成熟酶rt(marathonrt)。
19、在一些实施方案中，逆转录酶结构域相对于野生型序列可包含突变。
20、在一些实施方案中，m-mlv逆转录酶结构域可包含一个或更多个选自d200n、t306k、w313f、t330p和l603w的突变。
21、在一本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.使核酸位点特异性地整合到细胞基因组中的方法，所述方法包括：
2.权利要求1所述的方法，其中所述gRNA与被所述DNA结合核酸酶切口的基因组链的互补细胞基因组链杂交。
3.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述整合酶作为肽或编码所述整合酶的核酸引入。
4.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述DNA结合核酸酶作为肽或编码所述DNA结合核酸酶的核酸引入。
5.前述权利要求中任一项所述的方法，其中包含所述核酸的DNA或RNA链作为微环、质粒、mRNA或线性DNA引入到所述细胞中。
6.前述权利要求中任一项所述的方法，其中包含所述核酸的DNA或RNA链为1000bp至36,000bp。
7.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中包含所述核酸的DNA或RNA链大于36,000bp。
8.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中包含所述核酸的DNA或RNA链小于1000bp。
9.前述权利要求中任一项所述的方法，其中包含所述核酸的DNA作为微环引入到所述细胞中。
10.权利要求9
11.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述与逆转录酶结构域连接的DNA结合核酸酶与所述整合酶通过接头连接。
12.权利要求11所述的方法，其中所述接头是可切割的。
13.权利要求11所述的方法，其中所述接头是不可切割的。
14.权利要求11所述的方法，其中所述接头可被所述与逆转录酶连接的DNA结合核酸酶的两个关联结合结构域替代。
15.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述整合酶选自
16.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述整合酶是Bxb1或其突变体。
17.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述整合位点是attB位点、attP位点、attL位点、attR位点、lox71位点、Vox位点或FRT位点。
18.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述含有切口酶活性的DNA结合核酸酶选自Cas9-D10A、Cas9-H840A和Cas12a/b切口酶。
19.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述逆转录酶结构域选自莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶结构域、转录异种聚合酶(RTX)、禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶(AMV-RT)和直肠真杆菌成熟酶RT(MarathonRT)。
20.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述逆转录酶结构域相对于野生型序列包含突变。
21.权利要求19所述的方法，其中所述M-MLV逆转录酶结构域包含一个或更多个选自D200N、T306K、W313F、T330P和L603W的突变。
22.前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括引入第二切口指导RNA(ngRNA)。
23.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述gRNA、编码所述DNA结合核酸酶的核酸、所述逆转录酶、包含与互补或缔合的整合位点连接的核酸的DNA、所述整合酶和任选的所述ngRNA在单个反应中引入到细胞中。
24.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述gRNA、编码所述DNA结合核酸酶的核酸、所述逆转录酶、包含与互补整合位点连接的核酸的DNA、所述整合酶和任选的所述ngRNA使用病毒、RNP、mRNA、脂质或聚合物纳米粒来引入。
25.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸是报道基因。
26.权利要求25所述的方法，其中所述报道基因是荧光蛋白。
27.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞是分裂细胞。
28.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞是非分裂细胞。
29.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞基因组中的期望位置是突变基因的基因座。
30.前述权利要求1中任一项所述的方法，其中所述核酸是用于在小分子存在下可编程地敲低蛋白质的降解标签。
31.权利要求1所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞、细菌细胞或植物细胞。
32.权利要求1所述的方法，其中所述核酸是T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体(CAR)、白介素、细胞因子或用于整合到T细胞或自然杀伤(NK)细胞中的免疫检查点基因。
33.权利要求32所述的方法，其中使用微环DNA将所述TCR、所述CAR、所述白介素、所述细胞因子或所述免疫检查点基因并入到T细胞或NK细胞基因组的靶位点中。
34.权利要求1所述的方法，其中所述核酸是β血红蛋...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.使核酸位点特异性地整合到细胞基因组中的方法，所述方法包括：
2.权利要求1所述的方法，其中所述grna与被所述dna结合核酸酶切口的基因组链的互补细胞基因组链杂交。
3.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述整合酶作为肽或编码所述整合酶的核酸引入。
4.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述dna结合核酸酶作为肽或编码所述dna结合核酸酶的核酸引入。
5.前述权利要求中任一项所述的方法，其中包含所述核酸的dna或rna链作为微环、质粒、mrna或线性dna引入到所述细胞中。
6.前述权利要求中任一项所述的方法，其中包含所述核酸的dna或rna链为1000bp至36,000bp。
7.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中包含所述核酸的dna或rna链大于36,000bp。
8.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中包含所述核酸的dna或rna链小于1000bp。
9.前述权利要求中任一项所述的方法，其中包含所述核酸的dna作为微环引入到所述细胞中。
10.权利要求9所述的方法，其中所述微环不包含细菌来源的序列。
11.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述与逆转录酶结构域连接的dna结合核酸酶与所述整合酶通过接头连接。
12.权利要求11所述的方法，其中所述接头是可切割的。
13.权利要求11所述的方法，其中所述接头是不可切割的。
14.权利要求11所述的方法，其中所述接头可被所述与逆转录酶连接的dna结合核酸酶的两个关联结合结构域替代。
15.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述整合酶选自
16.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述整合酶是bxb1或其突变体。
17.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述整合位点是attb位点、attp位点、attl位点、attr位点、lox71位点、vox位点或frt位点。
18.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述含有切口酶活性的dna结合核酸酶选自cas9-d10a、cas9-h840a和cas12a/b切口酶。
19.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述逆转录酶结构域选自莫洛尼鼠白血病病毒(m-mlv)逆转录酶结构域、转录异种聚合酶(rtx)、禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶(amv-rt)和直肠真杆菌成熟酶rt(marathonrt)。
20.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述逆转录酶结构域相对于野生型序列包含突变。
21.权利要求19所述的方法，其中所述m-mlv逆转录酶结构域包含一个或更多个选自d200n、t306k、w313f、t330p和l603w的突变。
22.前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括引入第二切口指导rna(ngrna)。
23.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述grna、编码所述dna结合核酸酶的核酸、所述逆转录酶、包含与互补或缔合的整合位点连接的核酸的dna、所述整合酶和任选的所述ngrna在单个反应中引入到细胞中。
24.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述grna、编码所述dna结合核酸酶的核酸、所述逆转录酶、包含与互补整合位点连接的核酸的dna、所述整合酶和任选的所述ngrna使用病毒、rnp、mrna、脂质或聚合物纳米粒来引入。
25.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸是报道基因。
26.权利要求25所述的方法，其中所述报道基因是荧光蛋白。
27.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞是分裂细胞。
28.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞是非分裂细胞。
29.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞基因组中的期望位置是突变基因的基因座。
30.前述权利要求1中任一项所述的方法，其中所述核酸是用于在小分子存在下可编程地敲低蛋白质的降解标签。
31.权利要求1所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞、细菌细胞或植物细胞。
32.权利要求1所述的方法，其中所述核酸是t细胞受体(tcr)、嵌合抗原受体(car)、白介素、细胞因子或用于整合到t细胞或自然杀伤(nk)细胞中的免疫检查点基因。
33.权利要求32所述的方法，其中使用微环dna将所述tcr、所述car、所述白介素、所述细胞因子或所述免疫检查点基因并入到t细胞或nk细胞基因组的靶位点中。
34.权利要求1所述的方法，其中所述核酸是β血红蛋白(hbb)基因，并且所述细胞是造血干细胞(hsc)。
35.权利要求34所述的方法，其中使用微环dna将所述hbb基因并入到hsc基因组中的靶位点中。
36.权利要求34所述的方法，其中所述核酸是造成β地中海贫血或镰状细胞贫血的基因。
37.权利要求1所述的方法，其中所述核酸是代谢基因。
38.权利要求37中任一项所述的方法，其中所述代谢基因涉及α-1抗胰蛋白酶缺乏症或鸟氨酸转氨甲酰酶(otc)缺乏症。
39.权利要求37至38中任一项所述的方法，其中所述代谢基因是涉及遗传性疾病的基因。
40.权利要求1所述的方法，其中所述核酸是涉及遗传性疾病或遗传性综合征的基因。
41.权利要求40所述的方法，其中所述遗传性疾病是囊性纤维化、家族性高胆固醇血症、腺苷脱氨酶(ada)缺乏症、x-连锁scid(x-scid)、威斯科特-奥尔德里奇综合征(was)、血色素沉着病、泰-萨克斯病、脆性x综合征、亨廷顿病、马方综合征、苯丙酮尿症或肌营养不良。
42.载体，其包含这样的核酸，所述核酸编码含有切口酶活性的dna结合核酸酶，所述含有切口酶活性的dna结合核酸酶在c端与逆转录酶连接，所述逆转录酶经由接头与整合酶连接。
43.权利要求42所述的载体，其中所述接头是可切割的。
44.权利要求42所述的载体，其中所述接头是不可切割的。
45.权利要求42所述的载体，其中所述接头包含与逆转录酶连接的dna结合核酸酶的两个关联结合结构域。
46.权利要求42所述的载体，其中所述整合酶包含条件激活结构域或条件表达结构域。
47.权利要求46所述的载体，其中所述整合酶与雌激素受体融合。
48.权利要求42所述的载体，其中所述含有切口酶活性的dna结合核酸酶选自cas9-d10a、cas9-...
【专利技术属性】
技术研发人员：奥马尔·阿布达耶，乔纳森·古滕伯格，
申请(专利权)人：麻省理工学院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。