【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于但不限于基因工程，尤其涉及一种日本鳗鲡bmp-15重组蛋白及其表达方法与应用。
技术介绍
1、日本鳗鲡(anguilla japonica)是亚洲重要的洄游性鱼类之一，也是我国重要的经济鱼类。作为一种降海产卵的洄游性鱼类，日本鳗鲡具有复杂的生活史，而生活史的复杂性导致了包括生长、繁殖在内的诸多未知性，因此其人工繁殖技术是至今尚未解决的世界性难题。自上世纪30年代起，鳗鲡人工繁殖技术已经取得巨大进展，但是距产业化大规模繁育生产鳗苗的需求还有很大差距，主要原因是目前人工催熟亲鳗的成熟率、产卵率和产卵量低下，特别是产出的卵子质量并不理想，致使受精率、孵化率和成活率很低，而孵出的鳗苗虽然最终可以经过变态成长为白仔鳗苗，但生长速度十分缓慢，成活率极低，且畸形率高。我国作为鳗鲡养殖、加工、出口第一大国，对鳗苗的需求量极大，因此实现鳗鲡的人工繁殖迫在眉睫。而解决这些问题的关键，在于对日本鳗鲡卵巢发育过程进行调控，以提高人工繁殖鳗鲡的卵子质量。
2、骨形态发生蛋白15(bone morphogenetic protein 15,bmp15)是由卵母细胞特异性表达的卵巢调控因子，在卵黄积累以及防止卵母细胞早熟等生理机制中发挥重要功能，是卵母细胞向周围的卵泡细胞(颗粒细胞和膜细胞)发送信号来协调卵泡发生的关键角色。bmp-15可通过smad细胞信号通路上调激活素a(inhba)和卵巢芳香化酶(cyp19a1a)等基因的表达水平，对卵巢的发育具有重要调控作用。与其他脊椎动物相同，日本鳗鲡bmp-15为经典的分泌蛋白，具有典型
3、在基因工程领域中，大肠杆菌(escherichia coli)是原核表达系统常用的工程菌，属于一种兼性厌氧革兰氏阴性菌，其生长周期短，遗传背景清晰，培养操作简单、成本低廉，可以快速大规模地生产目的蛋白。通过使用强力的启动子，外源蛋白可在大肠杆菌中高水平表达。但是，大肠杆菌表达外源蛋白的速率远远高于真核生物，这导致新生肽链常常发生错误折叠，而错误折叠的蛋白疏水部分暴露、相互聚集，形成无活性的包涵体。
4、包涵体是原核表达中常见的问题，因肽链的错误折叠而使蛋白结构发生异常，失去生物活性。针对此问题，可通过包涵体变复性的方式，将错误折叠且不可溶的包涵体转变成具有正确分子结构的可溶蛋白，恢复其生物活性，获得具有生物活性的日本鳗鲡bmp-15重组蛋白。此外，包涵体变复性方式获得重组蛋白的效率更高，且不需纯化纯度即可达到80％～90％，在生产上可节省时间和成本，具有重要的现实意义。
5、通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
6、(1)目前并无日本鳗鲡bmp-15重组蛋白表达的相关报道；
7、(2)目前已有其它生物bmp-15重组蛋白表达的报道，但报道中大多采用真核表达的方式，该方式获得bmp-15重组蛋白的效率低、成本高；
8、(3)目前关于其它生物bmp-15重组蛋白原核表达的报道相对较少，且报道中bmp-15重组蛋白包涵体变复性效果差，透析过程中易析出，无法获得高浓度的bmp-15重组蛋白。
9、(4)大肠杆菌的重组蛋白表达速率过快，且无内质网、高尔基体等细胞器进行加工修饰，导致新生肽链常常不能及时正确折叠，而错误折叠的蛋白疏水部分暴露、相互聚集，形成无活性包涵体；
技术实现思路
1、针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种日本鳗鲡bmp-15重组蛋白诱导表达的方法，尤其涉及一种大肠杆菌表达系统生产的、通过包涵体变复性方式大量获得的日本鳗鲡骨形态发生蛋白15(bmp-15)重组蛋白及其在日本鳗鲡卵巢发育中的应用。
2、本专利技术是这样实现的，一种日本鳗鲡bmp-15重组蛋白，包含：日本鳗鲡bmp-15成熟肽氨基酸序列、n端的6×组氨酸标签(6×his标签或简称his标签)以及sumo促溶多肽；所述日本鳗鲡bmp-15重组蛋白的氨基酸序列如seq id no:1所示；
3、进一步，所述bmp-15成熟肽氨基酸序列如seq id no:2所示。
4、进一步，重组蛋白n端添加his标签以及连接肽，其氨基酸序列为hhhhhhssglvprgshmas；6×his标签(hhhhhh)用于对蛋白进行镍柱亲和层析，从而对日本鳗鲡bmp-15重组蛋白进行纯化，进一步提高重组蛋白纯度；在his标签与sumo促溶多肽之间添加了13个氨基酸ssglvprgshmas作为连接肽，防止his标签被sumo促溶多肽及日本鳗鲡bmp-15成熟肽遮蔽而能够充分暴露于溶液中，以便于在复性后对重组蛋白进行亲和层析纯化。
5、进一步，n端添加sumo促溶多肽，序列为msdsevnqeakpevkpevkpethinlkvsdgsseiffkikkttplrrlmeafa krqgkemdslrflydgiriqadqtpedldmedndiieahreqigg，用于抑制包涵体复性过程中的蛋白聚沉，进一步促进复性过程中可溶蛋白的形成，提升包涵体变复性的效率，这对提高包涵体变复性的效率及重组蛋白的浓度至关重要。
6、所述n端his标签及sumo促溶多肽不会影响日本鳗鲡bmp-15重组蛋白活性，不需要切除标签。
7、本专利技术的另一目的在于提供一种日本鳗鲡bmp-15重组蛋白的编码基因，包含：编码n端his标签、his标签与sumo促溶多肽之间的连接肽、sumo促溶多肽、日本鳗鲡bmp-15成熟肽；编码基因的dna序列为seq id no:3。
8、本专利技术的另一目的在于提供一种表达载体，所述表达载体包含日本鳗鲡bmp-15重组蛋白的编码基因和骨架质粒，所述骨架质粒由pet-32a(+)改造得到。
9、本专利技术的另一目的在于提供一种重组工程菌，所述重组工程菌包含所述表达载体。
10、进一步，所述重组工程菌的宿主菌选自rosetta-gami b(de3)。
11、本专利技术的另一目的在于提供一种日本鳗鲡bmp-15重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
12、(1)构建所述日本鳗鲡bmp-15重组蛋白编码基因，连接到骨架质粒上构建得到日本鳗鲡bmp-15重组蛋白的表达载体；
13、(2)将所述表达载体转化到宿主菌中，诱导表达日本鳗鲡bmp-15重组蛋白；
14、(3)通过包涵体变复性的方式，将错误折叠的不可溶包涵体转变为具有正确结构的可溶蛋白；
15、(4)基于所述日本鳗鲡bmp-15重组蛋白中的his标签亲和层析得到更本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种日本鳗鲡BMP-15重组蛋白，其特征在于，包含：日本鳗鲡BMP-15成熟肽氨基酸序列、N端的6×组氨酸标签以及SUMO促溶多肽；所述日本鳗鲡BMP-15重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种如权利要求1所述的日本鳗鲡BMP-15重组蛋白的编码基因，其特征在于，包含：编码N端His标签、His标签与SUMO促溶多肽之间的连接肽、SUMO促溶多肽、日本鳗鲡BMP-15成熟肽；编码基因的DNA序列为SEQ ID NO:3。
3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求2所述的日本鳗鲡BMP-15重组蛋白的编码基因和骨架质粒，所述骨架质粒由pET-32a(+)改造得到。
4.一种重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌包含权利要求3所述的表达载体。
5.如权利要求4所述的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌的宿主菌选自Rosetta-gami B。
6.一种如权利要求1所述的日本鳗鲡BMP-15重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.如权利要求6所述的日本鳗鲡BMP
8.一种如权利要求1所述的日本鳗鲡BMP-15重组蛋白在日本鳗鲡卵巢发育调控中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种日本鳗鲡bmp-15重组蛋白，其特征在于，包含：日本鳗鲡bmp-15成熟肽氨基酸序列、n端的6×组氨酸标签以及sumo促溶多肽；所述日本鳗鲡bmp-15重组蛋白的氨基酸序列如seq id no:1所示。
2.一种如权利要求1所述的日本鳗鲡bmp-15重组蛋白的编码基因，其特征在于，包含：编码n端his标签、his标签与sumo促溶多肽之间的连接肽、sumo促溶多肽、日本鳗鲡bmp-15成熟肽；编码基因的dna序列为seq id no:3。
3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求2所述的日本鳗鲡bmp-15重组蛋白的编码基因和骨架质粒，所述骨架质粒由...
【专利技术属性】
技术研发人员：齐鑫，左陈鹏，姜天宇，李昀，温海深，王孝杰，景潇，杨晶，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：
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