【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及蛋白质组学研究，具体为极微量提取酶解脱盐一体化试剂盒。
技术介绍
1、目前，蛋白质组学研究通常依赖高效样本制备方法以确保高灵敏度和高通量质谱分析。然而，传统的样本制备技术如滤膜辅助样本制备（fasp）和悬浮捕获法（strap），在处理超微量样本时存在以下显著限制：
2、其一是样本损失高，传统方法需要多步操作，包括转移步骤，易造成样本损失，尤其是处理低浓度蛋白时。其二是时间成本高，许多现有方法操作步骤繁琐，耗时较长，例如fasp中多轮的洗涤和离心。其三是兼容性问题，高效溶解蛋白所需的去污剂（如sds）对后续酶解和质谱分析不兼容，需移除这些试剂，这增加了样本处理复杂性。其四是微量样本挑战，当前技术对纳克甚至皮克级的样本处理效率较低，难以在单细胞或稀有生物样本中取得一致性和高回收率。
3、综上，现有技术无法满足对低浓度蛋白高灵敏度分析的需求，限制了其在临床诊断和基础研究中的应用。
4、因此，急需对此缺点进行改进，本专利技术则是针对现有的技术及不足予以研究改良，提供有极微量提取酶解脱盐一体化试剂盒。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供极微量提取酶解脱盐一体化试剂盒，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：极微量提取酶解脱盐一体化试剂盒，所述试剂盒基于改进的悬浮捕获技术，能够实现样本提取、酶解及脱盐的一体化操作，适用于超微量样本的高效处理，所述试剂盒的技术方案包括以下核心步骤：p>
3、蛋白捕获与洗涤：通过引入微型化玻璃纤维或硅酸盐过滤膜，优化蛋白捕获效率并移除干扰杂质，如去污剂和盐；
4、一体化处理：设计单管式微反应器，实现蛋白溶解、酶解和脱盐的整合，避免多步转移造成的样本损失；
5、高效酶解：采用优化的缓冲体系和试剂配比，确保蛋白在捕获状态下的完全酶解，避免传统方法中部分酶解的问题；
6、灵敏度提升：利用超微量反应体系和高效液相色谱（lc-ms）相结合，来显著提高低丰度蛋白和肽段的回收率。
7、进一步的，所述蛋白捕获与洗涤步骤的具体操作：将收集的细胞或组织样本经过处理后，与微型化玻璃纤维或硅酸盐过滤膜接触，利用玻璃纤维或过滤膜的吸附性能（玻璃纤维或过滤膜通过静电相互作用、疏水相互作用和氢键等原理，吸附样本中的蛋白质），将蛋白质从样本中捕获出来，并使用缓冲液或溶液（利用缓冲液或溶液的溶解性和离子交换作用）洗涤去除附着在玻璃纤维或过滤膜上的干扰杂质，如去污剂和盐。
8、进一步的，所述细胞或组织样本的处理，目标是将其转化为适合与微型化玻璃纤维或硅酸盐过滤膜接触的形态，从而进行有效的蛋白质捕获，具体如下：
9、样本裂解：使用含有离液剂、去污剂和酶等成分的裂解缓冲液对细胞或组织进行裂解，以释放其中的蛋白质；
10、去除杂质：通过离心、过滤的方法去除样本中的细胞碎片、核酸等其他杂质，以得到相对纯净的蛋白质溶液；
11、调节ph值和离子强度：根据后续处理步骤的要求，使用缓冲液调节蛋白质溶液的ph值和离子强度，以确保其与玻璃纤维或过滤膜的吸附性能相匹配。
12、进一步的，所述洗涤步骤中，缓冲液或溶液具体采用tris-hcl缓冲液、pbs缓冲液或去污剂溶液；
13、所述tris-hcl缓冲液用于调节蛋白质溶液的ph值，并提供一定的离子强度控制，其配置方法：将tris碱溶解在水中后，用浓盐酸调节ph值至7.4（或其他所需值），然后用蒸馏水定容至所需体积；
14、所述pbs缓冲液用于提供一定的离子强度和ph值控制，同时减少对蛋白质的干扰，其配置方法：将nacl、kcl、na2hpo4和kh2po4等盐类溶解于蒸馏水中后，用盐酸或氢氧化钠调节ph值至7.4（或其他所需值），然后用蒸馏水定容至所需体积；
15、所述去污剂溶液具有低离子强度和适当ph值（在本案中为7.4，也可以是其他所需值），以避免对蛋白质造成损害。
16、进一步的，所述一体化处理步骤的具体操作：将捕获的蛋白质样本置于单管式微反应器中，并在微反应器中依次加入溶解剂、酶解剂和脱盐剂，通过控制反应条件（如温度、ph值等），实现蛋白质的溶解、酶解和脱盐；
17、其中，溶解剂使蛋白质从玻璃纤维或过滤膜上溶解下来；酶解剂将蛋白质分解成肽段；脱盐剂去除肽段中的盐分。
18、进一步的，所述单管式微反应器的材料选择具有良好生物相容性和化学稳定性的材料，如不锈钢、玻璃或高分子材料等，且微反应器内部集成了多个功能区域，包括蛋白溶解区、酶解区和脱盐区等，所述功能区域通过微通道或微室相互连接，形成一个连续的处理流程；单管式微反应器通过优化结构设计和反应条件控制，实现蛋白质的溶解、酶解和脱盐过程的整合。
19、进一步的，所述高效酶解步骤的具体操作：在单管式微反应器中，将溶解后的蛋白质与酶解剂（如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等）混合，酶解剂中的酶能够识别并切割蛋白质中的特定肽键，将蛋白质分解成较小的肽段，并控制反应条件（如温度、ph值、酶解时间等），以优化酶的活性，使蛋白质在捕获状态下完全酶解。
20、进一步的，所述缓冲体系和试剂配比的优化流程如下：
21、1）缓冲体系的优化：
22、ph值调整（酶解过程对ph值非常敏感，不同的酶有不同的最适ph值范围）：通过实验确定目标蛋白所用酶的最适ph值，并据此调整缓冲体系的ph值，以确保酶解效率最大化；
23、盐浓度调整（适当的盐浓度可以维持酶的稳定性，促进底物与酶的结合，从而提高酶解效率）：通过实验确定最佳的盐浓度，以在保持酶活性的同时促进蛋白的完全酶解；
24、添加剂的加入：基于添加剂与被检测物质（如蛋白）的作用机理，以及是否会对后续步骤（如脱盐）产生影响，来选择添加剂，如无机电解质、非电解质高分子添加剂和表面活性剂等，并向缓冲体系中添加添加剂，以改善酶解效果；
25、2）试剂配比的优化
26、酶与底物的比例：通过实验确定最佳的酶与底物比例，以确保在有限的样本量下实现蛋白的完全酶解；
27、缓冲剂与酶的比例：缓冲剂在酶解过程中起到维持ph值和盐浓度稳定的作用，通过调整缓冲剂与酶的比例，来优化酶解环境，进一步提高酶解效率；
28、其他试剂的加入：根据实验需求，向反应体系中加入其他试剂，包括但不限于抑制剂、激活剂，这些试剂的加入量应经过精确计算和优化，以确保不会对酶解过程产生负面影响；
29、3）优化方法的实施与验证
30、实验设计：采用正交实验设计、响应面法的方法对缓冲体系和试剂配比进行优化，并设置不同的实验条件组合，全面考察各因素对酶解效率的影响；
31、数据分析：利用统计软件对实验数据进行处理和分析，通过比较不同条件下的酶解效率，确定最佳的缓冲体系和试剂配比；
32、验证实验：在最佳条件下进行验证实验，以确认优化后的缓本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.极微量提取酶解脱盐一体化试剂盒，其特征在于，所述试剂盒基于改进的悬浮捕获技术，能够实现样本提取、酶解及脱盐的一体化操作，所述试剂盒的技术方案包括以下核心步骤：
2.根据权利要求1所述的极微量提取酶解脱盐一体化试剂盒，其特征在于，所述蛋白捕获与洗涤步骤的具体操作：将收集的细胞或组织样本经过处理后，与微型化玻璃纤维或硅酸盐过滤膜接触，利用玻璃纤维或过滤膜的吸附性能，将蛋白质从样本中捕获出来，并使用缓冲液或溶液洗涤去除附着在玻璃纤维或过滤膜上的干扰杂质。
3.根据权利要求2所述的极微量提取酶解脱盐一体化试剂盒，其特征在于，所述细胞或组织样本的处理具体如下：
4.根据权利要求2所述的极微量提取酶解脱盐一体化试剂盒，其特征在于，所述洗涤步骤中，缓冲液或溶液具体采用Tris-HCl缓冲液、PBS缓冲液或去污剂溶液；
5.根据权利要求1所述的极微量提取酶解脱盐一体化试剂盒，其特征在于，所述一体化处理步骤的具体操作：将捕获的蛋白质样本置于单管式微反应器中，并在微反应器中依次加入溶解剂、酶解剂和脱盐剂，通过控制反应条件，实现蛋白质的溶解、酶解和脱
6.根据权利要求5所述的极微量提取酶解脱盐一体化试剂盒，其特征在于，所述单管式微反应器微反应器内部集成了若干功能区域，包括蛋白溶解区、酶解区和脱盐区，所述功能区域通过微通道或微室相互连接，形成一个连续的处理流程。
7.根据权利要求1所述的极微量提取酶解脱盐一体化试剂盒，其特征在于，所述高效酶解步骤的具体操作：在单管式微反应器中，将溶解后的蛋白质与酶解剂混合，酶解剂中的酶能够识别并切割蛋白质中的特定肽键，将蛋白质分解成较小的肽段，并控制反应条件，以优化酶的活性，使蛋白质在捕获状态下完全酶解。
8.根据权利要求7所述的极微量提取酶解脱盐一体化试剂盒，其特征在于，所述缓冲体系和试剂配比的优化流程如下：
9.根据权利要求1所述的极微量提取酶解脱盐一体化试剂盒，其特征在于，所述灵敏度提升步骤的具体操作：将酶解后的肽段样本置于超微量反应体系中，并使用高效液相色谱对肽段进行分离和检测。
10.根据权利要求9所述的极微量提取酶解脱盐一体化试剂盒，其特征在于，所述高效液相色谱根据肽段的性质和检测要求，配置高效液相色谱系统，并进行使用前的调试和校准，且高效液相色谱利用色谱柱的分离作用和质谱仪的检测作用，对肽段进行分离和检测，通过质谱仪的扫描和分析，获得肽段的信息，以实现对低丰度蛋白和肽段的回收和鉴定。
...【技术特征摘要】
1.极微量提取酶解脱盐一体化试剂盒，其特征在于，所述试剂盒基于改进的悬浮捕获技术，能够实现样本提取、酶解及脱盐的一体化操作，所述试剂盒的技术方案包括以下核心步骤：
2.根据权利要求1所述的极微量提取酶解脱盐一体化试剂盒，其特征在于，所述蛋白捕获与洗涤步骤的具体操作：将收集的细胞或组织样本经过处理后，与微型化玻璃纤维或硅酸盐过滤膜接触，利用玻璃纤维或过滤膜的吸附性能，将蛋白质从样本中捕获出来，并使用缓冲液或溶液洗涤去除附着在玻璃纤维或过滤膜上的干扰杂质。
3.根据权利要求2所述的极微量提取酶解脱盐一体化试剂盒，其特征在于，所述细胞或组织样本的处理具体如下：
4.根据权利要求2所述的极微量提取酶解脱盐一体化试剂盒，其特征在于，所述洗涤步骤中，缓冲液或溶液具体采用tris-hcl缓冲液、pbs缓冲液或去污剂溶液；
5.根据权利要求1所述的极微量提取酶解脱盐一体化试剂盒，其特征在于，所述一体化处理步骤的具体操作：将捕获的蛋白质样本置于单管式微反应器中，并在微反应器中依次加入溶解剂、酶解剂和脱盐剂，通过控制反应条件，实现蛋白质的溶解、酶解和脱盐；
6.根据权利要求5所述的极微量提取酶解脱盐一体化试剂盒，其特征在于，...
【专利技术属性】
技术研发人员：王磬，曾秋芳，魏珍，杨勇，
申请(专利权)人：康普博奥杭州生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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