【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，尤其涉及一种基于内源crispr-cas系统持续稳定表达glp-1的副干酪乳杆菌的制备方法。
技术介绍
1、糖尿病是一项重大的全球健康危机，其患病率在过去20年内几乎翻了一番。目前的治疗策略主要围绕胰岛素注射和口服降糖药展开，不仅给患者带来负担，而且无法长期给予患者提供最佳的血糖控制。
2、胰高血糖素样肽-1(glp-1)能够通过葡萄糖依赖的方式增强胰岛素分泌，从而降低与低血糖相关的风险，因此其成为糖尿病管理中的关键激素。glp-1是通过肠内胰高血糖素原基因的翻译后蛋白水解加工合成的。这种激素因营养摄入而分泌到血流中，作为一种葡萄糖依赖性促胰岛素肽发挥作用。具体而言，glp-1可增强口服葡萄糖或进食后的胰岛素分泌，同时还起到减缓胃排空并抑制胰高血糖素分泌。由于这些特性，glp-1在治疗ⅱ型糖尿病方面的潜力受到了极大关注。此外，glp-1可通过降低食欲来减少食物摄入，这使其成为控制肥胖的可行治疗方案。重要的是，作为一种葡萄糖依赖性肽，以glp-1为基础的疗法不会引发低血糖，因此可最大限度地降低糖尿病管理中这一常见不良反应的风险。艾塞那肽和利拉鲁肽等glp-1疗法已显示出改善血糖控制和减轻体重的前景。然而，这些疗法需要频繁注射，这可能是依从性的一大障碍。
3、目前现行的通过注射glp-1给药的治疗方案，不仅给患者带来了不便，而且限制了这一强效疗法的更广泛应用。我们迫切需要能够简化给药流程、提高患者依从性并延长glp-1治疗效果的新型给药系统。在探索的各种替代glp-1递送策略中，乳酸菌
4、乳酸菌是一种革兰氏阳性细菌，不含内毒素脂多糖，保证了其安全性，使其成为食品和医学研究的热门课题。agarwal p等利用乳酸乳球菌作为载体进行glp-1的重组表达。然而，与乳酸乳球菌相比，乳酸杆菌在胃肠道表现出更强的耐受性，并在肠上皮细胞上表现出更强的黏附和定植能力。干酪乳杆菌作为发酵食品中的代表性微生物，在平衡微生物菌群代谢、增强体质、促进肠道健康和免疫调节等方面发挥着重要作用。这些特性使其成为开发治疗性蛋白(如glp-1)口服递送系统的理想候选者。
5、现利用基因重组技术异源表达蛋白主要存在两种方案：第一种为质粒过表达方式。即将外源功能基因（通常是蛋白编码的基因）通过质粒载体导入细胞，使其在细胞内持续表达的方法。质粒过表达技术因其技术简单，操作门槛低而得到大规模应用。但目前基于质粒过表达产生大量特定蛋白的方法存在明显弊端，此类菌株在肠道中定殖时可能会由于胃肠道中缺乏选择性压力而丢失，导致其无法长效表达。
6、第二种为整合到基因组的方式。即利用同源重组或crispr-cas系统进行基因的定点敲入。同源重组技术依靠相同序列的两个分子之间交换dna来实现编辑的过程，这种过程确保了两个dna分子的精确交换。但它的效率一直是制约其应用的主要瓶颈。crispr-cas系统是原核生物中一种特殊的自身防御机制，对于入侵的外来dna/rna元件提供适应性免疫。其中ii-a型crispr-cas系统是目前使用最广泛的基因编辑工具之一。该系统由sgrna、crispr基因座、cas9核酸酶三部分组成，其中cas9核酸酶是rna引导的核酸酶，扮演着剪刀的角色，识别并切割pam上游的目标dna序列，产生双链断裂。借助非同源端连接(nhej)或同源性定向修复(hdr)的dna原生修复机制进行重组修复。由于hdr修复在修复序列前需提供同源修复模板，所以更适用于精确的基因组修饰。基于crispr同源性定向修复，能够实现对基因组的删除或插入。该系统的专一性、精确性和可编辑性使其得以广泛应用。
7、显然，crispr-cas基因组编辑技术已获得大量应用，但目前将其应用在乳酸菌中的研究相对较少，尤其是乳杆菌。若将crispr-cas9基因组编辑系统应用于乳杆菌，将大大改善目前基于同源重组方案效率过低的缺陷，更易实现基因组无痕修饰。
技术实现思路
1、本专利技术利用副干酪乳杆菌基因组编码的lpcas9核酸酶设计了内源性crispr-cas9基因组编辑系统。该系统不需要质粒携带大量外源cas蛋白构建体，大大减小了质粒的大小，提高了质粒向宿主菌的转化效率。本专利技术使用副干酪乳杆菌的原生crispr-cas9系统进行基因组整合避免了基于质粒的表达系统的缺陷(如不稳定和功能丧失)，提供了更可靠和持久的解决方案，使得副干酪乳杆菌持续稳定表达glp-1。基于此，本专利技术提出如下技术方案。
2、首先，本专利技术提供了一种核酸序列，其为如下一种：
3、（1）seq id no.1所示序列；
4、（2）seq id no.1所示序列的互补序列。
5、上述核酸序列为本专利技术设计筛选的具有较高编辑效率的编码sgrna的核酸序列。通过在质粒中使用该核酸序列，能够提高基因编辑效率。
6、进一步，本专利技术提供了含有所述核酸序列的生物材料。
7、优选地，所述生物材料包括但不限于重组dna、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或细胞。
8、优选地，本专利技术提供了一种质粒，其中含有所述的核酸序列。
9、优选地，所述质粒为含有crispr-cas系统工作所需基因元件的质粒。
10、优选地，所述crispr-cas系统为crispr-cas9系统。
11、优选地，所述质粒为ptrst。
12、ptrst质粒是以ptrkh2-amp为骨架质粒，加入了pldh-sgrna 和 lpcas9 scaffold元件后形成，公开于cn 116286928 a中。
13、优选地，所述核酸序列插入ptrst质粒的crrna插入位点处。
14、优选地，所述质粒中还包括表达盒；所述表达盒中含有启动子和目的基因glp-1；所述目的基因glp-1的核酸序列为seq id no.3所示。
15、优选地，所述启动子为乳酸脱氢酶启动子pldh。
16、优选地，所述表达盒中依次含有同源臂hr1、乳酸脱氢酶启动子pldh、目的基因glp-1以及同源臂hr2。
17、优选地，所述表达盒插入位点位于ptrst质粒的lp-scaffold之后。
18、优选地，所述同源臂hr1和同源臂hr2是以靶标基因eno设计；所述靶标基因eno的核酸序列为seq id no.4所示。
19、优选地，所述同源臂hr1是从靶标基因eno的起始密码子至上游1kb序列；优选地，所述同源臂hr1的序列为seq id no.5所示。
20、优选地，所述同源臂hr2是从靶标基因eno的终止密码子至下游1kb序列；优选地，所述同源臂hr2的序列为seq id no.6所示。
21、进一步，本专利技术提供了含有所述核酸序列、所述生物材料或所述质粒的微生物或细胞；优选地，所述微生物为副干酪乳杆菌。
22、采用副干酪乳杆菌时本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种核酸序列，其特征在于，其为如下一种：
2.含有权利要求1所述核酸序列的生物材料。
3.一种质粒，其特征在于，其中含有权利要求1所述的核酸序列。
4.根据权利要求3所述的质粒，其特征在于，所述质粒为含有CRISPR-Cas系统工作所需基因元件的质粒；优选地，所述质粒为pTRST。
5.根据权利要求4所述的质粒，其特征在于，所述质粒中还包括表达盒；所述表达盒中含有启动子和目的基因GLP-1；所述目的基因GLP-1的核酸序列为SEQ ID No.3所示。
6.根据权利要求5所述的质粒，其特征在于，所述表达盒中依次含有同源臂HR1、乳酸脱氢酶启动子pldh、目的基因GLP-1以及同源臂HR2。
7.含有权利要求1所述核酸序列、权利要求2所述生物材料或权利要求3~6中任一项所述质粒的微生物或细胞；优选地，所述微生物为副干酪乳杆菌。
8.权利要求1所述核酸序列、权利要求2所述生物材料、权利要求3~6中任一项所述质粒或权利要求7所述的微生物或细胞在制备用于治疗糖尿病或肥胖的药品中的应用。
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10.一种持续稳定表达GLP-1的副干酪乳杆菌的制备方法，其特征在于，包括：将权利要求1所述的核酸序列添加到骨架质粒上，然后在骨架质粒中添加同源臂HR1、乳酸脱氢酶启动子pldh、目的基因GLP-1以及同源臂HR2，形成基因编辑质粒；然后将所述基因编辑质粒转入到宿主副干酪乳杆菌中。
...【技术特征摘要】
1.一种核酸序列，其特征在于，其为如下一种：
2.含有权利要求1所述核酸序列的生物材料。
3.一种质粒，其特征在于，其中含有权利要求1所述的核酸序列。
4.根据权利要求3所述的质粒，其特征在于，所述质粒为含有crispr-cas系统工作所需基因元件的质粒；优选地，所述质粒为ptrst。
5.根据权利要求4所述的质粒，其特征在于，所述质粒中还包括表达盒；所述表达盒中含有启动子和目的基因glp-1；所述目的基因glp-1的核酸序列为seq id no.3所示。
6.根据权利要求5所述的质粒，其特征在于，所述表达盒中依次含有同源臂hr1、乳酸脱氢酶启动子pldh、目的基因glp-1以及同源臂hr2。
7.含有权利要求1所述核酸序列、权利要求2所...
【专利技术属性】
技术研发人员：逄晓阳，郑慕民，张书文，李旭，王筠钠，谢宁，王晓丹，
申请(专利权)人：中国农业科学院农产品加工研究所，
类型：发明
国别省市：
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