【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于凝血因子检测，具体涉及一种基于荧光定量测定凝血因子xiii活性的方法。
技术介绍
1、凝血因子是一组在血液凝固过程中起到关键作用的蛋白质，其共同参与了一个复杂的级联反应，确保在血管受损时能够迅速形成稳定的血栓，防止出血，并促进伤口愈合。其中凝血因子xiii(fxiii)是凝血级联反应中的最后一个因子，主要负责将可溶性的纤维蛋白单体交联成不溶性的稳定纤维蛋白多聚体，从而增强血栓的机械强度和稳定性。
2、由于fxiii在凝血过程中扮演着不可或缺的角色，fxiii的活性测试对于诊断与治疗相关的凝血障碍非常重要。目前定量测定fxiii活性的方法有氨释放法、异构肽酶活性测定和胺掺入法测定。其中氨释放法是通过测量fxiii介导的交联反应中产生的氨量来评估fxiii活性的一种方法。在这个过程中，fxiii催化特定底物中的ε-赖氨酰-γ-谷氨酰胺键的形成，当这些键形成时，会释放出氨。通过使用适当的缓冲液和ph指示剂，可以检测到氨的释放，进而计算出fxiii的活性。这种方法的优点是简单快速，但它的灵敏度可能不如其他方法，并且可能会受到样本中其他氨源的干扰。异构肽酶活性测定是基于fxiii的特异性底物的使用，这种底物可以在fxiii的作用下发生结构变化。通常，这类底物设计为包含一个荧光团和一个淬灭基团，两者被一段可以被fxiii识别并交联的多肽序列分隔开。当fxiii催化该多肽链的交联时，荧光团与淬灭基团之间的距离增加，导致荧光强度的增加。通过测量荧光的变化，可以间接地确定fxiii的活性。胺掺入测定是一种利用fxiii将
3、异构肽酶活性测定(也就是荧光底物法测定凝血因子xiii)具有灵敏度高、特异性好的优点，但是仍然存在以下缺点：
4、(1)即使在优化条件下，荧光底物也可能与样本中的其他蛋白质和杂质发生非特异性结合，导致背景荧光增加，这种背景信号会降低信噪比，影响结果的准确性。
5、(2)尽管设计的荧光底物旨在特异性识别fxiiia，但在实际应用中，可能存在其他酶类(如其他转谷氨酰胺酶)也能够切割同一底物的情况，导致交叉反应，这会影响对fxiiia活性的精确测量。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种基于荧光定量测定凝血因子xiii活性的方法，以解决上述荧光底物在实际应用中发生交叉反应和样本中的其他蛋白质影响测定过程导致测量准确性变差的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供了一种基于荧光定量测定凝血因子xiii活性的方法，包括以下步骤：
3、(1)样品预处理
4、将血浆样品经过皂土处理，得到血浆试样；
5、(2)待测试样制备
6、将血浆试样加入反应体系中，然后进行孵育，得到待测试样；
7、反应体系包括缓冲溶液、氯化钙、聚乙二醇、甘氨酸乙酯、海美溴铵和荧光底物；
8、(3)标准曲线的建立
9、制备一系列不同浓度的标准fxiii溶液，按照步骤(2)进行不同浓度的标准试样的制备，制备得到的标准试样在荧光测定仪上进行检测，以标准fxiii溶液的浓度百分比为横坐标，以孵育一段时间内荧光强度-时间曲线的斜率为纵坐标，绘制标准曲线；
10、(4)fxiii活性检测
11、将待测试样用荧光测定仪进行检测，得到待测试样的荧光强度，根据标准曲线计算得到待测试样的浓度。
12、优选的，步骤(1)中，向血浆样品中加入皂土，血浆样品和皂土的体积质量比为1ml：(20～50)mg，使用涡旋振荡器轻轻混匀，使皂土均匀分布于血浆样品中，混合时间为10～30s，混合后在室温下静置10～15min，然后在1000～3000r/min下离心10～15min，离心后，取上清液为血浆试样。
13、优选的，步骤(2)中，反应体系中缓冲溶液的浓度为50～100mm，氯化钙的浓度为8～12mm，聚乙二醇的质量分数为0.05～0.15％，甘氨酸乙酯的浓度为3～8mm，海美溴铵的浓度为3～8μg/ml，荧光底物的浓度为30～80μm。
14、优选的，缓冲溶液为pbs缓冲溶液、tris-hcl缓冲溶液、hepes缓冲溶液、n,n-二羟乙基甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷中的一种或几种。
15、优选的，步骤(2)中，血浆试样和反应体系的体积比为1：(10～20)。
16、优选的，步骤(2)中，孵育温度为35～38℃，孵育时间为0.01～2h。
17、优选的，步骤(2)中，荧光底物中包括荧光基团和荧光猝灭基团，其中荧光基团为2'-氨基苯甲酰苯胺，荧光猝灭基团为2,4-二硝基苯肼。
18、优选的，步骤(2)中，荧光底物的序列为：
19、(2-abz)-asn-glu(cad-dnp)-glu-gln-val-ser-pro-leu-thr-leu-leu-lys。
20、优选的，步骤(3)中，荧光测定仪的激发波长为313nm。
21、优选的，步骤(3)中，孵育时间为5～40min，以该时间段内荧光强度(y轴)-时间(x轴)进行线性回归分析，每个浓度百分比均对应一个斜率，最终以斜率(y轴)-浓度百分比(x轴)构建标准曲线。
22、因此，本专利技术采用上述结构的一种基于荧光定量测定凝血因子xiii活性的方法，具有以下有益效果：
23、(1)本专利技术通过使用缓冲溶液按(5～8):1的比例稀释血浆样品，可以有效降低血浆中高浓度蛋白质和其他成分对fxiii活性测定的影响，这种精确的稀释比例确保了样品中的fxiii浓度处于适宜的检测范围内，减少了非特异性干扰，提高了检测的灵敏度和准确性。
24、(2)本专利技术向稀释后的血浆样品中加入适量的皂土(每1ml血浆样品加入20～50mg皂土)，并通过涡旋振荡和离心处理，能够高效去除纤维蛋白原和其他大分子蛋白质。这不仅减少了这些成分对荧光信号的干扰，还避免了它们与fxiii反应体系中的其他成分发生非特异性结合，从而提高了检测的特异性和可靠性。
25、(3)本专利技术设置血浆试样与反应体系的体积比为1:(10～20)，这一比例既保证了足够的fxiii浓度用于检测，又不会因血浆成分过多而影响反应的进行。适当的体积比有助于维持反应体系的稳定性，减少血浆中其他成分的干扰，从而提高了检测的精确度和灵敏度。
26、(4)本专利技术的荧光底物中包含荧光基团(如2'-氨基苯甲酰苯胺)和荧光猝灭基团(如2,4-二硝基苯肼)，这种设计使得在fxiii催化下，荧光基团与猝灭基团分离，产生显本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于荧光定量测定凝血因子XIII活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种基于荧光定量测定凝血因子XIII活性的方法，其特征在于，步骤(1)中，向血浆样品中加入皂土，血浆样品和皂土的体积质量比为1mL：(20～50)mg，使用涡旋振荡器轻轻混匀，使皂土均匀分布于血浆样品中，混合时间为10～30s，混合后在室温下静置10～15min，然后在1000～3000r/min下离心10～15min，离心后，取上清液为血浆试样。
3.根据权利要求1所述的一种基于荧光定量测定凝血因子XIII活性的方法，其特征在于，步骤(2)中，反应体系中缓冲溶液的浓度为50～100mM，氯化钙的浓度为8～12mM，聚乙二醇的质量分数为0.05～0.15％，甘氨酸乙酯的浓度为3～8mM，海美溴铵的浓度为3～8μg/mL，荧光底物的浓度为30～80μM。
4.根据权利要求1或2所述的一种基于荧光定量测定凝血因子XIII活性的方法，其特征在于，缓冲溶液为PBS缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液、Hepes缓冲溶液、N,N-二羟乙基甘氨酸、三羟甲基
5.根据权利要求1所述的一种基于荧光定量测定凝血因子XIII活性的方法，其特征在于，步骤(2)中，血浆试样和反应体系的体积比为1：(10～20)。
6.根据权利要求1所述的一种基于荧光定量测定凝血因子XIII活性的方法，其特征在于，步骤(2)中，孵育温度为35～38℃，孵育时间为0.01～2h。
7.根据权利要求1所述的一种基于荧光定量测定凝血因子XIII活性的方法，其特征在于，步骤(2)中，荧光底物包括荧光基团和荧光猝灭基团，其中荧光基团为2'-氨基苯甲酰苯胺，荧光猝灭基团为2,4-二硝基苯肼。
8.根据权利要求7所述的一种基于荧光定量测定凝血因子XIII活性的方法，其特征在于，步骤(2)中，荧光底物的序列为：
9.根据权利要求1所述的一种基于荧光定量测定凝血因子XIII活性的方法，其特征在于，步骤(3)中，荧光测定仪的激发波长为313nm。
...【技术特征摘要】
1.一种基于荧光定量测定凝血因子xiii活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种基于荧光定量测定凝血因子xiii活性的方法，其特征在于，步骤(1)中，向血浆样品中加入皂土，血浆样品和皂土的体积质量比为1ml：(20～50)mg，使用涡旋振荡器轻轻混匀，使皂土均匀分布于血浆样品中，混合时间为10～30s，混合后在室温下静置10～15min，然后在1000～3000r/min下离心10～15min，离心后，取上清液为血浆试样。
3.根据权利要求1所述的一种基于荧光定量测定凝血因子xiii活性的方法，其特征在于，步骤(2)中，反应体系中缓冲溶液的浓度为50～100mm，氯化钙的浓度为8～12mm，聚乙二醇的质量分数为0.05～0.15％，甘氨酸乙酯的浓度为3～8mm，海美溴铵的浓度为3～8μg/ml，荧光底物的浓度为30～80μm。
4.根据权利要求1或2所述的一种基于荧光定量测定凝血因子xiii活性的方法，其特征在于，缓冲溶液为pbs缓冲溶液、t...
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋鹏，孙盼，李长清，马莉，王宗奎，杜晞，
申请(专利权)人：中国医学科学院输血研究所，
类型：发明
国别省市：
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