【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于工程菌改造，具体为一种高转化效率的刺糖多孢菌工程菌株、其构建方法及应用。
技术介绍
1、放线菌是一类具有重要工业应用价值的微生物，尤其在生产天然产物药物领域具有重要价值。放线菌能够产生多种生物活性物质，如抗生素、酶抑制剂、免疫抑制剂等，其中，抗生素是放线菌产生的最重要的天然产物之一，是新药研发宝贵的资源库。但在实际应用中，放线菌工业菌株普遍存在以下两个问题：1)遗传操作困难：放线菌的遗传操作相比其他微生物更为复杂，重要原因之一是由于它们具有多种天然防御机制。2)发酵产量低：缺乏高效的高产育种技术，高产菌株匮乏，发酵产量偏低。这大大限制了放线菌来源的天然产物药物研发进展。
2、多杀菌素是由刺糖多孢菌(saccharopolyspora spinosa)发酵产生的一类大环内酯类抗生素，具有高效、广谱杀虫作用，且具有非常低的哺乳动物毒性与优良的环境友好性，广泛应用于农业和畜牧业，是绿色农用抗生素的杰出代表，具有极高的市场价值。但刺糖多孢菌的遗传操作极为困难，多杀菌素的生成水平低。
3、为了克服这些限制，提高多杀菌素的工业生产水平，迫切需要构建一株遗传操作简便、发酵产量高的菌株。
技术实现思路
1、本专利技术的主要目的，解决刺糖多孢菌dna转化困难的问题，从而为多杀菌素的遗传操作和高产改造奠定重要的技术基础。
2、本专利技术的第一方面，提供一种高dna转化效率的刺糖多孢菌工程菌株，采用如下的技术方案：
3、一种高dna转化效率的
4、甲基化限制修饰(restriction modification,rm)系统，简称rm系统，是刺糖多孢菌所具有多种天然防御机制，专利技术人推测，刺糖多孢菌基因组内复杂的rm系统可能是导致该菌极难遗传转化的重要原因之一。rm系统阻碍外源dna的转化，从而限制外源基因的导入，使得遗传操作十分困难。而且rm系统不仅影响遗传转化效率，还可能对细胞的生理代谢产生重要影响，包括抗生素的生物合成途径，这是由于甲基化酶对基因组的表观遗传修饰可以显著影响某些功能或调控基因的表达，从而直接或间接影响抗生素的生物合成效率。
5、于是，本专利技术分析了刺糖多孢菌内源的10个rm系统，并进行逐一敲除，系统鉴定其对刺糖多孢菌遗传转化效率的影响。结果发现了其中三组rm系统(rm2、rm5、rm7)对该菌的接合转移效率及多杀菌素发酵产量具有重要影响。将三组rm系统进行组合敲除，大大解决了刺糖多孢菌dna转化效率低下的难题，并获得多杀菌素产量显著提高的菌株，为后续构建易于改造的高产工业菌株奠定了重要基础。
6、作为优选，所述rm系统为rm2、rm5、rm7中任意两者的自由组合。
7、作为优选，所述rm系统为rm2、rm5、rm7三者的组合。
8、本专利技术的第二方面，提供一种高dna转化效率的刺糖多孢菌工程菌株的构建方法，该方法是以刺糖多孢菌sas001为出发菌株，破坏刺糖多孢菌基因组中的rm系统，所述rm系统为rm2、rm5、rm7中的任一或组合。
9、作为优选，所述破坏是通过基因敲除、中断失活或抑制的手段破坏刺糖多孢菌基因组的所述rm系统。
10、具体地，通过基因敲除的手段破坏刺糖多孢菌基因组的rm系统，包括如下步骤：
11、s1.构建基于内源crispr-cas的基因敲除质粒；
12、s2.将基因敲除质粒导入作为出发菌的刺糖多孢菌内，经菌落pcr结合dna测序鉴定，获得刺糖多孢菌工程菌株。
13、作为优选，步骤s1中，构建基于内源crispr-cas的基因敲除质粒所使用到的靶向rm2系统的spacer序列由以下2条引物退火获得。
14、rm2-gf(5′-3′)：caacgctggtggatggacaaccggcacgatctga，如seq id no:4所示。
15、rm2-gr(5′-3′)：ggactcagatcgtgccggttgtccatccaccagc，如seq id no:5所示。
16、作为优选，步骤s1中，构建基于内源crispr-cas的基因敲除质粒所使用到的靶向rm5系统的spacer序列由以下2条引物退火获得。
17、rm5-gf(5′-3′)：caactccttgaagcagatgcggtcgagtggcttc，，如seq id no:6所示。
18、rm5-gr(5′-3′)：ggacgaagccactcgaccgcatctgcttcaagga，如seq id no:7所示。
19、作为优选，步骤s1中，构建基于内源crispr-cas的基因敲除质粒所使用到的靶向rm7系统的spacer序列由以下2条引物退火获得。
20、rm7-gf(5′-3′)：caacccgaggcggtgcgccggttctgcgagaagc，，如seq id no:8所示。
21、rm7-gr(5′-3′)：ggacgcttctcgcagaaccggcgcaccgcctcgg，如seq id no:9所示。
22、本专利技术的第三方面，提供上述高转化效率的刺糖多孢菌工程菌株的应用，用于提高刺糖多孢菌的遗传转化效率或用于发酵生产多杀菌素。
23、通过实施上述技术方案，相比于现有技术，本专利技术具有如下的有益效果：
24、本专利技术将刺糖多孢菌的rm2、rm5、rm7三组rm系统进行逐一或组合敲除，解决了刺糖多孢菌dna转化困难的难题，并获得多杀菌素产量显著提高的菌株，为后续构建易于改造的高产工业菌株奠定了重要基础。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种高DNA转化效率的刺糖多孢菌工程菌株，其特征在于，以Sas001作为出发菌，破坏刺糖多孢菌内源的甲基化限制修饰系统，所述RM系统为RM2、RM5、RM7中的任一或组合，Sas001的保藏日期为2024年12月02日，保藏编号为CGMCC No.32886。
2.根据权利要求1所述的刺糖多孢菌工程菌株，其特征在于，所述甲基化限制修饰系统为RM2、RM5、RM7中任意两者的自由组合。
3.根据权利要求1所述的刺糖多孢菌工程菌株，其特征在于，所述甲基化限制修饰系统为RM2、RM5、RM7三者的组合。
4.一种高DNA转化效率的刺糖多孢菌工程菌株的构建方法，其特征在于，该方法是以刺糖多孢菌Sas001为出发菌株，破坏刺糖多孢菌基因组中的甲基化限制修饰系统，所述甲基化限制修饰系统为RM2、RM5、RM7中的任一或组合。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述破坏是通过基因敲除、中断失活或抑制的手段破坏刺糖多孢菌基因组的所述甲基化限制修饰系统。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，通过基因敲除的手段破坏
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤S1中，构建基于内源CRISPR-Cas的基因敲除质粒所使用到的靶向RM2系统的spacer序列由以下2条引物退火获得。
8.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤S1中，构建基于内源CRISPR-Cas的基因敲除质粒所使用到的靶向RM5系统的spacer序列由以下2条引物退火获得。
9.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤S1中，构建基于内源CRISPR-Cas的基因敲除质粒所使用到的靶向RM7系统的spacer序列由以下2条引物退火获得。
10.如权利要求1-4任一项所述的刺糖多孢菌工程菌株的应用，其特征在于，用于提高刺糖多孢菌的DNA转化效率或用于发酵生产多杀菌素。
...【技术特征摘要】
1.一种高dna转化效率的刺糖多孢菌工程菌株，其特征在于，以sas001作为出发菌，破坏刺糖多孢菌内源的甲基化限制修饰系统，所述rm系统为rm2、rm5、rm7中的任一或组合，sas001的保藏日期为2024年12月02日，保藏编号为cgmcc no.32886。
2.根据权利要求1所述的刺糖多孢菌工程菌株，其特征在于，所述甲基化限制修饰系统为rm2、rm5、rm7中任意两者的自由组合。
3.根据权利要求1所述的刺糖多孢菌工程菌株，其特征在于，所述甲基化限制修饰系统为rm2、rm5、rm7三者的组合。
4.一种高dna转化效率的刺糖多孢菌工程菌株的构建方法，其特征在于，该方法是以刺糖多孢菌sas001为出发菌株，破坏刺糖多孢菌基因组中的甲基化限制修饰系统，所述甲基化限制修饰系统为rm2、rm5、rm7中的任一或组合。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述破坏是通过基因敲除、中断失活或抑制的手段破...
【专利技术属性】
技术研发人员：王文方，芦银华，何慧妍，刘合伟，陈少欣，
申请(专利权)人：上海师范大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。