【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及计算化学及酶工程领域，具体涉及一种定向固定化核酸酶p1、以及基于计算辅助设计的核酸酶p1定向亲和固定化方法。
技术介绍
1、在酶工程和生物催化领域，固定化技术作为一种有效提高酶的稳定性、活性保持率和重复使用率的重要手段，已被广泛应用于工业生产过程中的各种酶制剂固定。固定化酶可以避免酶的游离状态下容易发生的失活和降解问题，同时有助于提高反应效率、降低生产成本。然而，传统的酶固定化技术，如物理吸附、共价结合和包埋，通常存在固定化过程复杂、酶活性损失大、载体选择有限等问题，限制了其大规模应用。
2、核酸酶p1作为一种重要的核酸降解酶，从桔青霉发酵中首次发现，其具有磷酸二酯酶和磷酸单酯酶的双重活性，广泛应用于dna、rna的降解、核苷酸提取、分析检测等领域，具有显著的工业应用价值。核酸酶p1由270个氨基酸组成，分子质量约为44kda，其活性位点含有三个与磷配位的zn2+，它们都位于结合裂隙的底部，对其催化功能至关重要。然而，核酸酶p1在游离状态下稳定性较差，容易受到环境因素(如温度、ph值、有机溶剂等)的影响，导致其在实际应用中的重复使用率低、操作复杂，无法充分发挥其潜在的工业价值。近年来，分子模拟技术和计算辅助设计(cad)在酶工程中的应用越来越受到重视。通过分子动力学模拟和静电分析等手段，可以有效预测酶分子的结构特征、活性位点及与载体的相互作用，进而为酶的定向固定化提供指导。因此，如何实现核酸酶p1的高效、稳定固定化是一个亟待解决的技术问题。
技术实现思路
2、本专利技术还要解决的技术问题是提供一种基于修饰剂修饰的定向固定核酸酶p1的定向固定化核酸酶p1。
3、为了解决上述技术问题，本专利技术公开了采用的技术方案如下：
4、一种基于计算辅助设计的核酸酶p1定向亲和固定化方法，包括如下步骤：
5、(1)获取并分析核酸酶p1的晶体结构，识别其表面的静电势分布和亲疏水区域；
6、(2)根据步骤(1)核酸酶p1表面的静电势分布和亲疏水区域结果，选择多巴胺分子da和带电聚合物分子作为修饰剂，分别构建对应的分子模型；
7、(3)将步骤(2)构建的分子模型进行结构优化和能量优化；
8、(4)利用步骤(3)优化后的分子模型，构建包含水、核酸酶p1及修饰剂的模拟体系，并通过加入钠离子中和体系净电荷；
9、(5)对步骤(4)的模拟体系进行分子动力学模拟，分析核酸酶p1在修饰剂环境中的动态行为；
10、(6)根据核酸酶p1的动态行为的分析结果，构建基于修饰剂修饰的定向固定化核酸酶p1。
11、其中，步骤(1)中，在识别核酸酶p1表面的静电势分布和亲疏水区域前，需将核酸酶p1的晶体结构转换为分子模拟的拓扑文件。
12、具体的，步骤(1)中，所述的核酸酶p1的晶体结构从pdb库中获取，经过去除结晶水，去除配体，质子化后由gromacs程序处理得到拓扑文件。
13、其中，步骤(1)中，利用分子可视化软件(如pymol、chimera、vmd等)分析核酸酶p1表面的静电势分布和亲疏水区域。
14、具体的，步骤(2)中所述的核酸酶p1的表面静电势区域分布由pymol程序经过apbs工具计算得到，表面亲疏水区域分布由chimera分析残基分布得到。
15、具体的，所述的核酸酶p1的表面静电势区域分布对于分析酶的催化机制及其与底物或其他分子的结合模式具有重要意义，所述表面亲疏水区域分布的绘制有助于评估其在水溶性环境中的稳定性和可能的相互作用界面。
16、其中，步骤(2)中，所述多巴胺分子和带电聚合物分子在构建对应的分子模型时需质子化。
17、其中，步骤(2)中，所述带电聚合物分子为聚乙烯亚胺分子pei、聚乙二醇分子peg、聚赖氨酸分子epl中的任意一种或几种的组合。优选为聚乙烯亚胺分子pei。
18、其中，步骤(3)中，所述将步骤(2)构建的分子模型进行结构优化和能量优化后，需要转换为用于计算的分子模型拓扑文件。
19、其中，步骤(4)中，在所述包含水、核酸酶p1及修饰剂的模拟体系中，将水、核酸酶p1及修饰剂构建成功具有边界周期性条件的立方盒子。
20、具体的，所述立方盒子大小为8.9nm×8.9nm×8.9nm。
21、具体的，所述核酸酶p1距离立方盒子边缘＞1.0nm；所述修饰剂为多巴胺分子和带电聚合物分子，多巴胺分子和带电聚合物分子在立方盒子中的位置随机，所述多巴胺分子和带电聚合物分子的摩尔比为1～3：1。
22、优选的，所述多巴胺分子和带电聚合物分子的摩尔比为3：1。在本专利技术的一些实施例中，添加300个多巴胺分子、100个带电聚合物分子到立方盒子中。
23、其中，步骤(5)中，在正式进行分子动力学模拟前，先利用最陡下降法模拟1000～10000步使得模拟体系能量最小化，再在298.15k反应温度、1bar反应压力的恒定条件下进行2～10ns的系综模拟，使得模拟体系中溶质和溶剂充分混合的同时允许立方盒子压缩至合理密度。
24、优选的，先利用最陡下降法模拟5000步，使得模拟体系能量最小化，以消除体系搭建产生的不合理接触。
25、具体的，所述系综模拟包括nvt和npt系综模拟，优选的持续时间分别为5ns。
26、具体的，所述298.15k反应温度采用v-rescale方法来恒定，其耦合时间常数为0.2ps；所述1bar反应压力采用parrinello-rahman方法来恒定，其耦合时间常数为0.5ps。
27、其中，步骤(6)中，所述分子动力学模拟，其时长设定为10～100ns，时间步长为1～2fs。
28、优选的，步骤(6)中，所述分子动力学模拟，其时长设定为100ns，时间步长为2fs。
29、具体的，所述分子动力学模拟采用leap-frog算法进行积分。使用cut-off算法计算范德华相互作用，截断半径被设为1.1nm。使用particle mesh ewald(pme)算法对长程静电相互作用进行计算，截断距离设为1.1nm。
30、其中，步骤(5)中，所述的动态行为包括核酸酶p1与修饰剂的相互作用能、均方根偏差、均方根波动、溶剂可及面积等。
31、一种基于修饰剂修饰的定向固定化核酸酶p1也在本专利技术所保护的范围之内。其中，所述定向固定化核酸酶p1是基于所述核酸酶p1定向亲和固定化方法指导下构建而成。
32、其中，所述修饰剂为多巴胺da和带电聚合物；其中，所述带电聚合物分子本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于计算辅助设计的核酸酶P1定向亲和固定化方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的核酸酶P1定向亲和固定化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述多巴胺分子和带电聚合物分子在构建对应的分子模型时需质子化；所述带电聚合物分子为聚乙烯亚胺分子PEI、聚乙二醇分子PEG、聚赖氨酸分子EPL中的任意一种或几种的组合。
3.根据权利要求1所述的核酸酶P1定向亲和固定化方法，其特征在于，步骤(4)中，在所述包含水、核酸酶P1及修饰剂的模拟体系中，将水、核酸酶P1及修饰剂构建成功具有边界周期性条件的立方盒子；
4.根据权利要求1所述的核酸酶P1定向亲和固定化方法，其特征在于，步骤(5)中，在正式进行分子动力学模拟前，先利用最陡下降法模拟1000～10000步使得模拟体系能量最小化，再在298.15K、1bar的恒定条件下进行2～10ns的系综模拟，使得模拟体系中溶质和溶剂充分混合的同时允许立方盒子压缩至合理密度。
5.根据权利要求1所述的核酸酶P1定向亲和固定化方法，其特征在于，步骤(6)中，所述分子动力学模拟，其时长设定为
6.一种基于多巴胺和带电聚合物修饰的定向固定化核酸酶P1，其特征在于，所述定向固定化核酸酶P1基于权利要求1～5任意一项所述核酸酶P1定向亲和固定化方法指导下构建而成。
7.根据权利要求6所述的定向固定化核酸酶P1，其特征在于，所述定向固定化核酸酶P1为利用多巴胺分子和带电聚合物分子改性介孔树脂后得到改性载体，再将改性载体分散在核酸酶P1溶液中孵育，得到所述定向固定化核酸酶P1。
8.根据权利要求6所述的定向固定化核酸酶P1，其特征在于，所述定向固定化核酸酶P1为利用多巴胺分子和带电聚合物分子改性介孔树脂后得到改性载体，将改性载体利用戊二醛进行二次改性，再将二次改性得到的改性载体加入刀豆凝集素A溶液中得到特异性修饰的改性载体，最后将特异性修饰的改性载体分散在核酸酶P1溶液中孵育，得到所述定向固定化核酸酶P1。
9.根据权利要求7或8所述的定向固定化核酸酶P1，其特征在于，所述带电聚合物分子为聚乙烯亚胺分子PEI、聚乙二醇分子PEG、聚赖氨酸分子EPL中的任意一种或几种的组合；所述多巴胺分子和带电聚合物分子的摩尔比为1～3：1；所述介孔树脂为羟基化树脂、胺基化树脂、季铵化树脂中的任意一种；所述核酸酶P1溶液的溶剂为0.05～0.20M，pH 6.0～8.0的PBS缓冲液。
10.根据权利要求8所述的定向固定化核酸酶P1，其特征在于，所述刀豆凝集素A溶液，溶剂为含有0.05～0.20M金属离子的0.05～0.20M，pH 6.0～8.0的PBS缓冲液；其中，所述金属离子为锰离子、钙离子、钾离子中的任意一种。
...【技术特征摘要】
1.一种基于计算辅助设计的核酸酶p1定向亲和固定化方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的核酸酶p1定向亲和固定化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述多巴胺分子和带电聚合物分子在构建对应的分子模型时需质子化；所述带电聚合物分子为聚乙烯亚胺分子pei、聚乙二醇分子peg、聚赖氨酸分子epl中的任意一种或几种的组合。
3.根据权利要求1所述的核酸酶p1定向亲和固定化方法，其特征在于，步骤(4)中，在所述包含水、核酸酶p1及修饰剂的模拟体系中，将水、核酸酶p1及修饰剂构建成功具有边界周期性条件的立方盒子；
4.根据权利要求1所述的核酸酶p1定向亲和固定化方法，其特征在于，步骤(5)中，在正式进行分子动力学模拟前，先利用最陡下降法模拟1000～10000步使得模拟体系能量最小化，再在298.15k、1bar的恒定条件下进行2～10ns的系综模拟，使得模拟体系中溶质和溶剂充分混合的同时允许立方盒子压缩至合理密度。
5.根据权利要求1所述的核酸酶p1定向亲和固定化方法，其特征在于，步骤(6)中，所述分子动力学模拟，其时长设定为10～100ns，时间步长为1～2fs。
6.一种基于多巴胺和带电聚合物修饰的定向固定化核酸酶p1，其特征在于，所述定向固定化核酸酶p1基于权利要求1～5任意一项所述核酸酶p1定向亲和固定化方法指导下构建...
【专利技术属性】
技术研发人员：庄伟，张吉行，吉思雯，应汉杰，陈佳乐，吴菁岚，杨朋朋，邹逢霞，吴斌，郑诚，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
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