【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及多肽合成，具体涉及一种多肽合成过程中三对二硫键的定位环化方法。
技术介绍
1、二硫键是多肽序列中一对半胱氨酸残基上的巯基经氧化形成的s-s共价键，是维持多肽空间立体结构，以及保证生物学活性的重要结构。在生物体内，二硫键的形成是由酶调控完成的，可以精确配对，但在化学合成中会遇到许多问题。当肽链中有两个半胱氨酸残基的情况下，还可能会产生分子间的二硫键甚至多分子聚合的杂质。而当需要配对的巯基个数增多，仅肽链内都可能会产生二硫键错配或不配对的复杂情况，再引入分子间的二硫键配对后，复杂程度立即以指数飙升。
2、专利cn1120174c、专利cn110698553a、专利cn110894225a、专利cn116836255a、专利cn118530327a、专利cn113735955a、专利cn104974237a、专利cn109021087a，在合成过程中，6个保护半胱氨酸均使用同一种保护基，多数使用trt、个别专利则使用acm、tbu，在裂解后统一得到无任何保护基的线性多肽，再使用含有各类缓冲盐，弱氧化性的溶液，或直接选择空气氧化，使线性肽通过自由折叠的方式进行二硫键环化最终得到目标产物，但专利中均未能提供有效的鉴定方法用于准确鉴别二硫键的位置是否与芋螺肽的空间结构相同，且部分专利对于难度较大的tbu保护基的脱除方法并未进行实例说明，我们在尝试使用tbu保护基时，使用高浓度的tfa并尝试高温加热的情况下，均无法有效脱除，在尝试酸性更强的三氟甲磺酸等有机酸时，出现降解情况，粗肽纯度明显降低，继续延长反应时间，则产物
3、专利cn112279905a在合成过程中的6个保护半胱氨酸，选用两种不同的保护基，分别为trt和stbu，优先脱除stbu保护基后，完成第1对二硫键环化，再脱除trt保护基，通过空间优势构象使之随机完成另外两对二硫键的自由环化，该方法已被证明得到的并非正确的芋螺肽结构。
4、专利cn106496315a合成过程中选用的三组保护基分别为mtt、trt、acm，同样采用逐步脱保护逐步环化的方式完成合成，其中mtt保护基的脱除方法为0.5%tfa/dcm溶液，trt保护基则使用6%tfa/dcm。我们在重复该实验时发现，0.5%tfa/dcm仅能脱除极少部分mtt保护基，需将tfa浓度提升至5%才可完全脱除，且在脱除过程中出现部分trt保护基同步被脱除的现象。而专利cn107216374a则把脱除mtt的反应浓度提升至3%tfa/dcm。两种方法虽均可得到齐考诺肽产物，但仍难以避免错位环化产生的杂质。可见mtt和trt保护基并不能起到很好的正交保护效果。
5、另也有出现选用trt、acm、mob三组保护基，一方面acm脱保护的反应时间为2-5小时，周期长，另一方面mob脱保护液有的采用含三氟甲磺酸的裂解液，实际脱除效果并不好，产物大部分被降解掉，也有的采用剧毒管制品醋酸汞，并不利于后续的放大实验。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种多肽合成过程中三对二硫键的定位环化方法，它能够确保可在脱保护过程中单独使参与环化的一对半胱氨酸脱保护完全，且不参与环化的半胱氨酸保护基则完全不被脱除，保证环化过程中二硫键位置的精确定位，同时脱保护反应周期短而安全。
2、为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：
3、一种多肽合成过程中三对二硫键的定位环化方法，具体包括如下步骤：
4、s1、固相合成全保护线性多肽树脂，其中全保护线性多肽树脂中含有三对半胱氨酸，其中一对半胱氨酸侧链采用trt保护，再一对半胱氨酸侧链采用acm保护，另一对半胱氨酸侧链采用pmeobz保护；
5、s2、将全保护线性多肽树脂加入裂解液中，切除树脂的同时脱去除acm和pmeobz以外的所有侧链保护基，滤除树脂后沉淀、洗涤和干燥得到第一中间肽；
6、s3、将上述第一中间肽溶解在第一酸性溶液中，加入碘/甲醇溶液进行第一次环化反应；
7、s4、监测确认完成第1对二硫键环化后再加入碘/甲醇溶液，脱除acm保护基同时进行第二次环化反应，反应15min-30min；监测确认完成第2对二硫键环化，加入亚硫酸钠溶液，淬灭碘单质；再进行过滤、纯化并冻干，得到第二中间肽；
8、s5、将步骤s4的第二中间肽溶解于tfa中，tfa的溶度为25mg/ml-35mg/ml，加入三异丙基硅烷作为清除剂，密封处理，置于80℃-100℃水浴加热反应，监测确保完全脱除pmeobzl保护基，然后冷却、沉淀、洗涤干燥，得到第三中间肽；
9、s6、将步骤s5的第三中间肽溶解于第二酸性溶液中，加入1当量碘/甲醇溶液进行第三次环化反应，监测确认完成第3对二硫键环化，经纯化冻干得到含三对二硫键的环肽。
10、优选地，所述树脂为rink amide-am resin、sieber amide resin或deg-rinkamide-am resin，其取代度为0.30 mmol/g-0.65mmol/g。
11、优选地，所述监测采用高效液相色谱法及ms质谱分析。
12、优选地，所述步骤s3和s6中的纯化采用半制备型hplc过柱纯化。
13、优选地，所述步骤s3中的第一酸性溶液和步骤s6中的第二酸性溶液均为乙酸：甲醇：水=1-1.5:7.5-8:1，第一中间肽和第三中间肽的浓度为8mg/ml-15mg/ml。
14、优选地，所述步骤s3的碘/甲醇溶液中含有碘单质：1.5eq≥当量≥1.0eq；所述步骤s4的碘/甲醇溶液中含有碘单质：10eq≥当量≥5eq。
15、优选地，所述全保护线性多肽树脂为pglu-gly-cys(pmeobzl)-cys(acm)-asn(trt)-gly-pro-lys(boc)-gly-cys(trt)-ser(tbu)-ser(tbu)-lys(boc)-trp(boc)-cys(pmeobzl)-arg(pbf)-asp(otbu)-his(trt)-ala-arg(pbf)-cys(acm)-cys(trt)-树脂。
16、优选地，所述步骤s2的裂解液由三氟乙酸、苯甲醚、二硫苏糖醇、三异丙基硅烷、水组成，所述全保护线性多肽树脂与裂解液的比例为1g：10ml-20ml，反应时间60min-180min，反应温度30±5℃。
17、优选地，所述全保护线性多肽树脂为cys(acm)-lys(boc)-gly-lys(boc)-gly-ala-lys(boc)-cys(trt)-ser(tbu)-arg(pbf)-leu-met-tyr(tbu)-asp(otbu)-cys(pmeobzl)-cys(acm)-thr(tbu)-gly-ser(tbu)-cys(trt)-arg(pbf)-ser(tbu)-gly-lys(boc)-cys(pmeobzl)-树脂。
18、优选地，所述步骤s2的裂解液由三氟乙酸、苯甲本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种多肽合成过程中三对二硫键的定位环化方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的多肽合成过程中三对二硫键的定位环化方法，其特征在于：所述树脂为Rink Amide-AM Resin、Sieber Amide Resin或DEG-Rink Amide-AM Resin，其取代度为0.30 mmol/g-0.65mmol/g。
3.根据权利要求1所述的多肽合成过程中三对二硫键的定位环化方法，其特征在于：所述监测采用高效液相色谱法及MS质谱分析。
4.根据权利要求1所述的多肽合成过程中三对二硫键的定位环化方法，其特征在于：所述步骤S3和S6中的纯化采用半制备型HPLC过柱纯化。
5.根据权利要求1所述的多肽合成过程中三对二硫键的定位环化方法，其特征在于：所述步骤S3中的第一酸性溶液和步骤S6中的第二酸性溶液均为乙酸：甲醇：水=1-1.5:7.5-8:1，第一中间肽和第三中间肽的浓度为8mg/mL-15mg/mL。
6.根据权利要求1所述的多肽合成过程中三对二硫键的定位环化方法，其特征在于：所述步骤S3的
7.根据权利要求1至6任一项所述的多肽合成过程中三对二硫键的定位环化方法，其特征在于：所述全保护线性多肽树脂为pGlu-Gly-Cys(pMeOBzl)-Cys(Acm)-Asn(Trt)-Gly-Pro-Lys(Boc)-Gly-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Trp(Boc)-Cys(pMeOBzl)-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-His(Trt)-Ala-Arg(Pbf)-Cys(Acm)-Cys(Trt)-树脂。
8.根据权利要求7所述的多肽合成过程中三对二硫键的定位环化方法，其特征在于：所述步骤S2的裂解液由三氟乙酸、苯甲醚、二硫苏糖醇、三异丙基硅烷、水组成，所述全保护线性多肽树脂与裂解液的比例为1g：10mL-20mL，反应时间60min-180min，反应温度30±5℃。
9.根据权利要求1至6任一项所述的多肽合成过程中三对二硫键的定位环化方法，其特征在于：所述全保护线性多肽树脂为Cys(Acm)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Gly-Ala-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Leu-Met-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Cys(pMeOBzl)-Cys(Acm)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Cys(pMeOBzl)-树脂。
10.根据权利要求9所述的多肽合成过程中三对二硫键的定位环化方法，其特征在于：所述步骤S2的裂解液由三氟乙酸、苯甲醚、苯甲硫醚、二硫苏糖醇、三异丙基硅烷、水组成，所述全保护线性多肽树脂与裂解液的比例为1g：10mL-20mL，反应时间60min-180min，反应温度30±5℃。
...【技术特征摘要】
1.一种多肽合成过程中三对二硫键的定位环化方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的多肽合成过程中三对二硫键的定位环化方法，其特征在于：所述树脂为rink amide-am resin、sieber amide resin或deg-rink amide-am resin，其取代度为0.30 mmol/g-0.65mmol/g。
3.根据权利要求1所述的多肽合成过程中三对二硫键的定位环化方法，其特征在于：所述监测采用高效液相色谱法及ms质谱分析。
4.根据权利要求1所述的多肽合成过程中三对二硫键的定位环化方法，其特征在于：所述步骤s3和s6中的纯化采用半制备型hplc过柱纯化。
5.根据权利要求1所述的多肽合成过程中三对二硫键的定位环化方法，其特征在于：所述步骤s3中的第一酸性溶液和步骤s6中的第二酸性溶液均为乙酸：甲醇：水=1-1.5:7.5-8:1，第一中间肽和第三中间肽的浓度为8mg/ml-15mg/ml。
6.根据权利要求1所述的多肽合成过程中三对二硫键的定位环化方法，其特征在于：所述步骤s3的碘/甲醇溶液中含有碘单质：1.5eq≥当量≥1.0eq；所述步骤s4的碘/甲醇溶液中含有碘单质：10eq≥当量≥5eq。
7.根据权利要求1至6任一项所述的多肽合成过程中三对二硫键的定位环化方法，其特征在于：所述全保护线性多肽树脂为pglu-gly-cys(pmeobzl)-cys(acm)-asn(trt)-gly-pro-lys(boc)-...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑钟建，喻亦辉，田新铃，蔡加尊，何润泽，
申请(专利权)人：厦门胜泽泰医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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