【技术实现步骤摘要】
：本专利技术属于生物催化，具体涉及一种酮还原酶突变体及其在制备(r)-2-羟基-3,3-二甲基丁酸中的应用。
技术介绍
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技术介绍
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1、(r)-2-羟基-3,3-二甲基丁酸，结构式如i所示，cas号为22146-57-2，是一种重要的医药中间体，可以用于合成制备治疗血栓性心脑血管疾病的凝血酶抑制剂类药物分子等，未来该化合物可以用于制备更多的新药化合物。
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3、专利us7109004b2公开化合物i的制备路线如scheme 1所示，该路线以3,3-二甲基丁酮酸乙酯为起始物料，在kred1001的作用下发生还原反应制得(r)-2-羟基-3,3-二甲基丁酸乙酯，碱性条件下水解酯基得到(r)-2-羟基-3,3-二甲基丁酸，两步反应总收率在80％左右。
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5、专利cn1497046a公开了一种来源于肠系膜明串珠菌葡聚糖亚种菌株atcc 17072的酮酸还原酶，可以将三甲基丙酮酸直接还原为(r)-2-羟基-3,3-二甲基丁酸，路线如scheme 2所示，但是该酮酸还原酶活力较低。
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7、因此，我们需要构建一种新的酮还原酶，并用于(r)-2-羟基-3,3-二甲基丁酸的制备。
技术实现思路
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技术实现思路
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1、本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于制备(r)-2-羟基-3,3-二甲基丁酸的酮还原酶突变体。
2、一方面，本专利技术提供了一种新的酮还原酶突变体，
3、进一步，所述野生型酮还原酶来源于lentilactobacillus kefiri，野生型模板ncbi的登录号为wp_054768785.1，氨基酸序列和核苷酸序列分别如seq id no.1和seq idno.2所示。
4、进一步，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列如seq id no.3、5、7所示。
5、进一步，所述酮还原酶突变体的核苷酸序列如seq id no.4、6、8所示。
6、进一步，所述酮还原酶突变体表达于大肠杆菌e.coli bl(21)de3。
7、进一步，所述酮还原酶突变体的表达载体为pet28a，但不限于pet系列。
8、另一方面，本专利技术提供一种利用酮还原酶突变体制备(r)-2-羟基-3,3-二甲基丁酸的方法。该方法以三甲基丙酮酸为底物，在酮还原酶突变体的催化作用下转化为(r)-2-羟基-3,3-二甲基丁酸。
9、进一步，所述酮还原酶突变体以酮还原酶酶粉、酮还原酶酶液、酮还原酶均质液、酮还原酶冻干粉、含有酮还原酶的细胞等形式参与催化反应，优选酮还原酶均质液和冻干粉。
10、进一步，反应体系中可以加入辅酶促进反应，当采用含酮还原酶的细胞时，细胞内部含有少量辅酶，此时也可以不加入辅酶；某些情况下制备的酮还原酶酶粉中亦含有少量辅酶，此时也可以不加入辅酶。但反应体系中也可以加入辅酶进一步促进反应进行，当反应体系中加入辅酶促进反应时，所述辅酶选自nad+、nadh、nadp+、nadph或它们的组合物，优选nadph和nadp+。
11、更进一步，添加辅酶的浓度为0.02～0.4g/l，优选为0.04～0.2g/l。
12、更进一步，本技术方案中所采用的辅酶，均选自尚科生物医药(上海)有限公司对外销售的辅酶产品。
13、进一步，所述反应中需要加入氢供体，所述氢供体选自甲醇、乙醇、异丙醇、葡萄糖，优选葡萄糖。
14、进一步，所述底物浓度为10～300g/l，优选10～200g/l。
15、进一步，所述反应时间为1h～48h，优选12h～24h。
16、进一步，所述反应需要控制ph为6.0～8.0，优选ph为6.5～7.5。
17、进一步，所述反应温度为20℃～50℃，优选30～40℃。
18、本专利技术的有益效果在于，本专利技术提供了一种新的酮还原酶突变体，该突变体可以高效催化三甲基丙酮酸转化为(r)-2-羟基-3,3-二甲基丁酸，转化率≥85％，产物手性纯度≥99％，该方法操作简单，原子经济性高，可以用于工业化生产。
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1.一种酮还原酶突变体，其特征在于，以SEQ ID NO.1所示的野生型酮还原酶氨基酸序列为参考序列，在第84、94、102、131、152、180、194、201、203、244位发生单点或者多点突变。其中，第84位缬氨酸突变为亮氨酸，第94位丙氨酸突变为甘氨酸，第102位苏氨酸突变为丝氨酸，第131位天冬酰胺突变为蛋氨酸，第152位苏氨酸突变为丝氨酸，第180位天冬氨酸突变为天冬酰胺，第194位脯氨酸突变为酪氨酸，第201位甘氨酸突变为丙氨酸，第203位谷氨酸突变为天冬氨酸，第244位缬氨酸突变为亮氨酸。
2.如权利要求1所述的酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3、5、7所示。
3.如权利要求1所述的酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4、6、8所示。
4.如权利要求1所述的酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶突变体表达于大肠杆菌E.coliBL(21)DE3。
5.一种制备(R)-2-羟基-3,3-二甲基丁酸的方法，其特征在于，三甲基
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述酮还原酶突变体以酶粉、酶液、均质液、冻干粉、含有酶的细胞等形式参与催化反应。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述辅酶选自NAD+、NADH、NADP+、NADPH或它们的组合物。
8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，底物浓度为10～300g/L。
9.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述反应温度为20℃～50℃。
10.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述反应需要控制pH为6.0～8.0。
...【技术特征摘要】
1.一种酮还原酶突变体，其特征在于，以seq id no.1所示的野生型酮还原酶氨基酸序列为参考序列，在第84、94、102、131、152、180、194、201、203、244位发生单点或者多点突变。其中，第84位缬氨酸突变为亮氨酸，第94位丙氨酸突变为甘氨酸，第102位苏氨酸突变为丝氨酸，第131位天冬酰胺突变为蛋氨酸，第152位苏氨酸突变为丝氨酸，第180位天冬氨酸突变为天冬酰胺，第194位脯氨酸突变为酪氨酸，第201位甘氨酸突变为丙氨酸，第203位谷氨酸突变为天冬氨酸，第244位缬氨酸突变为亮氨酸。
2.如权利要求1所述的酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列如seq id no.3、5、7所示。
3.如权利要求1所述的酮还原酶突变体，其特征在于，所述酮还原酶突变体的核苷酸序列如seq id no.4、6、8所示。
4.如权利要求1所述的酮还原酶突变体，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：竺伟，王波，李肖肖，张小飞，
申请(专利权)人：尚科生物医药上海有限公司，
类型：发明
国别省市：
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