【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于疫苗制备，尤其涉及一种兼抗番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒的弱毒疫苗及其构建方法与应用。
技术介绍
1、番茄褪绿病毒(tomato chlorosis virus,tocv)与番茄黄化曲叶病毒(tomatoyellow leafcurl virus,tylcv)主要侵染茄科作物，目前tocv与tylcv的发生范围与严重程度逐年递增，且在田间二者极易发生复合侵染，已对我国的番茄种植区造成了严重的经济损失，极大程度地阻碍了我国番茄产业的发展。
2、基于交叉保护原理的弱毒疫苗防治是目前控制病毒病的一种有效策略。交叉保护是利用弱毒突变体侵染，诱导植物自身的免疫系统而防治后期侵染同类型强病毒株系。一种弱毒突变体只能用来防治对应的强病毒，并不能同时防治不同的病毒。现有技术公开的防治两种病毒的疫苗，是利用骨架病毒中插入异源病毒片段，来达到既防治骨架病毒，又防治插入片段对应病毒的弱毒疫苗。这种疫苗的防控病毒的能力弱，防控病毒的种类少。并不能达到除了防控骨架病毒外的其他两种以及两种以上的异源病毒的能力。
3、基于此，提出本专利技术。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种除了防控骨架病毒外，还能防控两种或两种以上的异源病毒的弱毒疫苗。尤其涉及一种兼抗番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒的弱毒疫苗及其构建方法与应用。
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种兼抗番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒的弱毒
4、所述抗番茄褪绿病毒的突变体包括番茄褪绿病毒的基因片段以及空载载体；
5、所述番茄褪绿病毒的基因片段如seq id no.1～5所示的基因片段中的任意一条，所述空载载体为含有cmvfny分离物的突变型rna2或trv的突变型；
6、所述抗番茄黄化曲叶病毒的突变体包括番茄黄化曲叶病毒的基因片段以及空载载体；
7、所述番茄黄化曲叶病毒的基因片段如seq id no.6或seq id no.7所示，所述空载载体为含有cmvfny分离物的突变型rna2或trv的突变型。
8、优选的，所述含有cmvfny分离物的突变型rna2为pccfr2-2bptii载体；
9、所述trv的突变型为trv2-vector载体。
10、优选的，扩增seq id no.1所示的基因片段的引物对如seq id no.8～9或seq idno.10～11所示；
11、扩增seq id no.2所示的基因片段的引物对如seq id no.12～13或seq id no.14～15所示；
12、扩增seq id no.3所示的基因片段的引物对如seq id no.16～17或seq id no.18～19所示；
13、扩增seq id no.4所示的基因片段的引物对如seq id no.20～21或seq id no.22～23所示；
14、扩增seq id no.5所示的基因片段的引物对如seq id no.24～25或seq id no.26～27所示。
15、优选的，扩增seq id no.6所示的基因片段的引物对如seq id no.28～29或seqid no.30～31所示；
16、扩增seq id no.7所示的基因片段的引物对如seq id no.32～33或seq id no.34～35所示。
17、本专利技术还提供了所述的弱毒疫苗的构建方法，包括如下步骤：
18、(1)以番茄褪绿病毒的基因组为模板，利用引物对扩增相应的基因片段；
19、(2)将步骤(1)所述的基因片段和空载载体进行双酶切后，连接，得到抗番茄褪绿病毒的突变体；
20、(3)以番茄黄化曲叶病毒的基因组为模板，利用引物对扩增相应的基因片段；
21、(4)将步骤(3)所述的基因片段和空载载体进行双酶切后，连接，得到抗番茄黄化曲叶病毒的突变体；
22、(5)将抗番茄褪绿病毒的突变体和抗番茄黄化曲叶病毒的突变体混合，得到弱毒疫苗。
23、优选的，步骤(2)所述的双酶切的酶切位点为bamhⅰ与smaⅰ或bamhⅰ与xbaⅰ。
24、优选的，步骤(4)所述的双酶切的酶切位点为bamhⅰ与smaⅰ或bamhⅰ与xbaⅰ。
25、本专利技术还提供了所述的弱毒疫苗在制备兼抗番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒的产品中的应用。
26、本专利技术还提供了一种兼抗番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒的试剂盒，所述试剂盒中包括兼抗番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒的弱毒疫苗；
27、所述兼抗番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒的弱毒疫苗为所述的弱毒疫苗或者按照所述的构建方法构建得到的弱毒疫苗。
28、本专利技术还提供了一种兼抗番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒的方法，包括如下步骤：
29、将弱毒疫苗接种至作物中，得到兼抗番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒的作物；所述弱毒疫苗为所述的弱毒疫苗或者按照所述的构建方法构建得到的弱毒疫苗。
30、所述作物为茄科作物或本氏烟。
31、本专利技术提供了一种兼抗番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒的弱毒疫苗及其构建方法与应用。本专利技术分别基于含有cmvfny分离物的突变型rna2质粒载体pccfr2-2bptii载体与基于trv改造的tr v2-vector质粒载体，构建了共计14个靶标tocv与tylcv的插入型弱毒突变体，这些突变体在本氏烟和番茄植株中均可稳定遗传且交叉保护。将基于同种载体的两种异源病毒片段突变体混合接种可以扩大弱毒疫苗的防治范围，不仅可以防控载体病毒，还能防控两种异源病毒，对于靶标病毒单侵染的防效与组分中单剂防效无明显区别；对于靶标病毒的复合侵染，可以将植株内病毒的平均含量控制在复合侵染对照植株的30％左右。为tocv与tylcv单侵染及复合侵染的防治提供了技术支撑。
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1.一种兼抗番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒的弱毒疫苗，其特征在于，所述弱毒疫苗包括抗番茄褪绿病毒的突变体和抗番茄黄化曲叶病毒的突变体；
2.根据权利要求1所述的弱毒疫苗，其特征在于，所述含有CMVFny分离物的突变型RNA2为pCCFR2-2bPTII载体；
3.根据权利要求1所述的弱毒疫苗，其特征在于，扩增SEQ ID NO.1所示的基因片段的引物对如SEQ ID NO.8～9或SEQ ID NO.10～11所示；
4.根据权利要求1所述的弱毒疫苗，其特征在于，扩增SEQ ID NO.6所示的基因片段的引物对如SEQ ID NO.28～29或SEQ ID NO.30～31所示；
5.权利要求1～4任意一项所述的弱毒疫苗的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述的双酶切的酶切位点为BamHⅠ与SmaⅠ或BamHⅠ与XbaⅠ。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)所述的双酶切的酶切位点为BamHⅠ与SmaⅠ或BamHⅠ与XbaⅠ。p>
8.权利要求1～4任意一项所述的弱毒疫苗在制备兼抗番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒的产品中的应用。
9.一种兼抗番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括兼抗番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒的弱毒疫苗；
10.一种兼抗番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种兼抗番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒的弱毒疫苗，其特征在于，所述弱毒疫苗包括抗番茄褪绿病毒的突变体和抗番茄黄化曲叶病毒的突变体；
2.根据权利要求1所述的弱毒疫苗，其特征在于，所述含有cmvfny分离物的突变型rna2为pccfr2-2bptii载体；
3.根据权利要求1所述的弱毒疫苗，其特征在于，扩增seq id no.1所示的基因片段的引物对如seq id no.8～9或seq id no.10～11所示；
4.根据权利要求1所述的弱毒疫苗，其特征在于，扩增seq id no.6所示的基因片段的引物对如seq id no.28～29或seq id no.30～31所示；
5.权利要求1～4任意一项所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：竺晓平，刘佳欣，原雪峰，朱常香，赵丹，尚凯杰，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：
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