【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及食品加工，提供了一种ε-聚赖氨酸结合壳聚糖的纳米纤维膜固定化酶及其制备方法和应用。
技术介绍
1、柚柑类水果具有独特的风味和高营养价值。富含维生素a、维生素c、维生素b1、b2等营养素，果皮中含有果胶和膳食纤维，果肉中富含有机酸，同时含有丰富的类黄酮等生物活性物质，具有抗氧化能力、有益身体健康等作用。柑橘类水果因其果肉饱满多汁，水分含量高，适合加工成果汁产品。但在榨汁、杀菌过程中会导致柚皮苷和柠檬苦素的含量提高，这两类物质是柑橘类果汁苦味产生的主要原因，严重影响果汁的口感风味。
2、柚苷酶经常被用来进行果汁的脱苦和降解，它是一种具有β-d-葡萄糖苷酶和α-l-鼠李糖苷酶活性的水解多酶复合物。柚苷酶脱苦降解反应过程分为两步，即α-l-鼠李糖苷酶水解柚苷生成樱桃苷和鼠李糖，β-d-葡萄糖苷酶水解樱桃苷生成柚皮素和葡萄糖。柚皮素是一种无苦味物质，从而达到脱苦的效果。在生产使用中，游离的柚苷酶却有不稳定、成本高、难以回收和再循环等缺点。而通过固定化酶的方法可以提高酶的稳定性和刚性，增加重复利用次数，便于果汁与酶的分离，大大降低了生产成本。
3、随着纳米技术的发展，纳米级固定化载体得到广泛的应用。通过静电纺丝技术制备的纳米纤维拥有非常大的表面积与体积比，具有优越的柔韧性和较小孔径及高孔隙率。壳聚糖是一种天然无毒可生物降解的多糖，具有多个羟基和氨基等活性基团。带有正电荷的壳聚糖分子与带负电的微生物表面之间通过静电相互作用，改变微生物膜的通透性，从而达到抑菌的作用。然而壳聚糖不溶于水溶液，使其使用被限制。
4、目前，固定化载体与柚苷酶的结合通常使用交联剂。戊二醛作为交联剂之一被广泛使用，它能与载体和酶形成强共价键，容易获得且成本低。然而戊二醛有毒性，使其应用浓度受到限制，导致酶与载体的结合率较低，并且其在交联过程中易形成团块，并结合在酶活性位点上，使酶活性降低或丧失。双醛壳聚糖是一种绿色、无毒的多糖，醛基与固定化载体的氨基和酶的氨基反应，形成强共价键，能够将酶固定在载体上。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种绿色交联、稳定性高、絮凝效果好、协同抑菌的ε-聚赖氨酸结合壳聚糖的纳米纤维膜固定化酶及其制备方法和在果汁处理中的应用，该固定化酶同时具备脱苦、澄清及抗菌效果。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供了一种ε-聚赖氨酸结合壳聚糖的纳米纤维膜固定化酶，其通过如下方法制备：使用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)活化ε-聚赖氨酸的羧基，然后与壳聚糖的羟基进行酯化反应，所得反应液作为静电纺丝溶液进行静电纺丝，得到ε-聚赖氨酸结合壳聚糖的纳米纤维膜；在酸性环境中，ε-聚赖氨酸结合壳聚糖的纳米纤维膜上的氨基和柚苷酶的氨基分别与交联剂双醛壳聚糖上的两个醛基结合形成强共价键，使柚苷酶固定在ε-聚赖氨酸结合壳聚糖的纳米纤维膜上，得到ε-聚赖氨酸结合壳聚糖的纳米纤维膜固定化酶。
4、第二方面，本专利技术提供了一种第一方面所述的ε-聚赖氨酸结合壳聚糖的纳米纤维膜固定化酶的制备方法，包括如下步骤：
5、(1)用静电纺丝制备ε-聚赖氨酸结合壳聚糖的纳米纤维膜：将ε-聚赖氨酸溶于蒸馏水中，制备6-8wt％的ε-聚赖氨酸溶液；将壳聚糖粉末溶解在1-4vol％的乙酸水溶液中得到2-4wt％的壳聚糖溶液；将体积比为20：60-100壳聚糖溶液和ε-聚赖氨酸溶液混合，在混合溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)，在75-85℃下搅拌1-2h，得到静电纺丝溶液，通过静电纺丝工艺得到ε-聚赖氨酸结合壳聚糖的纳米纤维膜；
6、(2)将1-4g的ε-聚赖氨酸结合壳聚糖的纳米纤维膜添加到80-140ml的柚苷酶溶液中得到混合物，所述柚苷酶溶液是通过将柚苷酶溶解在乙酸盐缓冲液中获得，其中柚苷酶浓度为2-3mg/ml，乙酸盐缓冲液ph值为4.5-5.0；将混合物与交联剂双醛壳聚糖进一步混合，于25-35℃水浴震荡90-180min，震荡速度为80-100r/min，然后用乙酸盐缓冲液洗涤，得到ε-聚赖氨酸结合壳聚糖的纳米纤维膜固定化酶。
7、作为优选，步骤(1)中，edc的加入量为1-15mg/ml，更优选4-7mg/ml。
8、作为优选，步骤(1)中，所述乙酸水溶液中乙酸体积浓度为1-3％，更优选2％。
9、作为优选，步骤(1)中，用静电纺丝溶液填充配有金属针的塑料注射器，注射器的针头连接到高压电源，静电纺丝工艺的参数具体设置为：电压为3-30kv，静电纺丝溶液的流速为1-5ml/h，针头距离收集器5-30cm。
10、作为优选，步骤(2)中，所述ε-聚赖氨酸结合壳聚糖的纳米纤维膜和柚苷酶溶液的投料比为(1-2)g：(80-100)ml；所述交联剂双醛壳聚糖的加入质量占混合物质量的2-4％。
11、本专利技术中，所述的双醛壳聚糖通过如下方法制备：将偏高碘酸钠和壳聚糖混合，使用碳酸氢钠和盐酸(稀释)将混合物的ph值调节到3.5，在40℃下避光反应90min，通过加入乙二醇终止反应；然后，使用异丙醇(ipa)沉淀形成交联剂，并使用真空过滤分离。
12、第三方面，本专利技术提供了第一方面所述的ε-聚赖氨酸结合壳聚糖的纳米纤维膜固定化酶在果汁处理中的应用。该应用中，所述的ε-聚赖氨酸结合壳聚糖的纳米纤维膜固定化酶能同时起到澄清、脱苦和抑菌的作用。
13、作为优选，所述果汁处理中，调节果汁ph为4.0～6.0，处理温度为40～45℃，处理时间为1～1.5h。
14、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
15、1、本专利技术提供的ε-聚赖氨酸结合壳聚糖制备纳米纤维膜具有高表面积比、优异的韧性、较小孔径和高孔隙率的优点。ε-聚赖氨酸是一种天然抗菌剂，有抑菌谱广、水溶性好、安全性高、热稳定性好等特点，两者的结合具有杀菌作用。同时含有大量的氨基，在酸性环境下，使得纳米纤维膜表面带正电荷，与果汁中的微粒发生电荷中和以及架桥吸附，发生絮凝沉淀以达到澄清的效果。
16、2、本专利技术提供的ε-聚赖氨酸结合壳聚糖的纳米纤维膜固定化酶做到果汁澄清和脱苦同时进行，并且有抗菌的作用。由于在酸性条件下，纳米纤维膜表面带正电荷，柚苷酶也带正电荷，同电荷相互排斥，因此通过绿色无毒的双醛壳聚糖作为交联剂将它们连接。交联剂本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种ε-聚赖氨酸结合壳聚糖的纳米纤维膜固定化酶，其特征在于：所述ε-聚赖氨酸结合壳聚糖的纳米纤维膜固定化酶通过如下方法制备：使用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化ε-聚赖氨酸的羧基，然后与壳聚糖的羟基进行酯化反应，所得反应液作为静电纺丝溶液进行静电纺丝，得到ε-聚赖氨酸结合壳聚糖的纳米纤维膜；在酸性环境中，ε-聚赖氨酸结合壳聚糖的纳米纤维膜上的氨基和柚苷酶的氨基分别与交联剂双醛壳聚糖上的两个醛基结合形成强共价键，使柚苷酶固定在ε-聚赖氨酸结合壳聚糖的纳米纤维膜上，得到ε-聚赖氨酸结合壳聚糖的纳米纤维膜固定化酶。
2.一种如权利要求1所述的ε-聚赖氨酸结合壳聚糖的纳米纤维膜固定化酶的制备方法，包括如下步骤：
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的加入量为1-15mg/mL。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的加入量为4-7mg/mL。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述ε-聚赖氨酸结合壳聚糖的纳米纤维膜和柚苷酶溶液的投料比为(1-2)g：(80-100)mL；所述交联剂双醛壳聚糖的加入质量占混合物质量的2-4％。
7.如权利要求1所述的ε-聚赖氨酸结合壳聚糖的纳米纤维膜固定化酶在果汁处理中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述果汁处理中，调节果汁pH为4.0～6.0，处理温度为40～45℃，处理时间为1～1.5h。
...【技术特征摘要】
1.一种ε-聚赖氨酸结合壳聚糖的纳米纤维膜固定化酶，其特征在于：所述ε-聚赖氨酸结合壳聚糖的纳米纤维膜固定化酶通过如下方法制备：使用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化ε-聚赖氨酸的羧基，然后与壳聚糖的羟基进行酯化反应，所得反应液作为静电纺丝溶液进行静电纺丝，得到ε-聚赖氨酸结合壳聚糖的纳米纤维膜；在酸性环境中，ε-聚赖氨酸结合壳聚糖的纳米纤维膜上的氨基和柚苷酶的氨基分别与交联剂双醛壳聚糖上的两个醛基结合形成强共价键，使柚苷酶固定在ε-聚赖氨酸结合壳聚糖的纳米纤维膜上，得到ε-聚赖氨酸结合壳聚糖的纳米纤维膜固定化酶。
2.一种如权利要求1所述的ε-聚赖氨酸结合壳聚糖的纳米纤维膜固定化酶的制备方法，包括如下步骤：
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的加入量为1-15mg/ml。
4.如权利要求3所述的制...
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