【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物传感，具体涉及一种检测蛋白酶的巨磁阻生物传感器及其制备方法和应用。
技术介绍
1、蛋白酶是水解蛋白质或多肽中肽键的一类酶的总称，包括β-分泌酶、胰蛋白酶和基质金属蛋白酶等，其在机体代谢、血管功能、免疫功能和细胞凋亡等生命活动中起着重要的作用。蛋白酶广泛分布于人体内，并参与人体的众多生理功能。人体内部分蛋白酶含量的异常变化与多种疾病发展有直接或间接的关系，例如，
2、β-分泌酶(β-secretase)的异常表达与阿尔茨海默病相关；胰蛋白酶的异常表达与胰腺相关疾病如急性胰腺炎和胰腺癌相关；基质金属蛋白酶-9的异常表达与慢性阻塞性肺疾病相关；基质金属蛋白酶-2的异常表达与女性盆底功能障碍性疾病相关；因此，蛋白酶活性的监测在生物医学领域具有重要的意义。
3、目前蛋白酶活性检测方法，主要有高效液相色谱法、质谱法、酶联免疫法(elisa)和荧光共振能量转移(fret)探针法。高效液相色谱和质谱法灵敏度高，普适性也较强，但需要精密的设备、复杂的操作和专业人员长时间的分析，分析成本较高，不适用于快速检测的需求。而elisa法和fret探针法虽然也有效，但在实际应用中均存在一定的困境，比如elisa法存在抗体价格昂贵、重复性差、操作繁琐及分析周期长等缺点，fret荧光探针法是通过化学键合的方法将荧光供体和荧光受体分别连接在酶底物肽的两端来形成的，而由于荧光供体和猝灭受体的制备过程非常复杂、合成成本高、而且标记步骤繁琐、周期长，此外，由于一些容易标记的荧光基团的激发波长往往与许多药物小分子的吸收波长重合，
4、近年来，巨磁阻(gmr)传感器与磁标记技术以及生物传感技术相结合发展起来的巨磁阻(gmr)生物传感器，由于具有灵敏度高、响应快速，可集成化和小型化的优点，在生物传感
备受关注。gmr生物传感器是一种通过磁标记生物探针从而实现对生物样本的检测，由于磁性标记非常稳定，不受光漂白的影响，也没有很强的环境噪声，因此其在稳定性和抗干扰能力方面也具有独特的优势。目前研究者利用gmr生物传感器已实现了对肝癌基因分型(xiao zhi et al.lab chip,2012,12,741-745)、dna突变(g.rizzi et al.acsnano,2017,11,8864-8870.)、流感激活基因(n.ravi et al.biosensors andbioelectronics，2022，205，114086-9)、抗sars-cov-2中和抗体(e.ng et al.sensorsandactuators b:chemical，2023，387,133773-6)、c反应蛋白(meng-zhe tsai etal.analyst,2018,143,503-510)以及骨肉瘤细胞(d.su et al.sensors andactuators a，2023，1，114115-9)等的检测。这些研究工作主要是基于dna分子之间的核酸杂交反应或抗原与抗体之间免疫反应来实现生物分子间识别，从而来建立生物传感方法，因此传感器的生物识别元件为dna探针或抗体与抗原，而利用多肽与酶之间的相互作用来建立生物传感方法的研究却鲜见报道。
5、事实上，多肽作为生物传感器的生物识别元件，与抗体相比，它稳定、可靠、成本低，易于合成及改造，并且具有高的亲和性，较强的生物活性等优点，在生物分子检测中具有独特的优势(y.jia et al.chem.res.chinese universities,2021,37(4),1130-6.)。因此，若能以功能多肽作为生物识别元件，构建gmr生物传感器用于检测蛋白酶，则可以极大发挥磁标记、多肽探针以及gmr传感器相互融合的优势，为蛋白酶检测及其抑制剂筛选提供一种全新的工具和手段。
6、鉴于上述技术背景，本专利技术提供了一种检测蛋白酶的巨磁阻生物传感器及其制备方法和应用，并利用该传感器实现了蛋白酶的简单灵敏检测，在重大疾病的诊断、治疗以及相关药物开发领域有广阔应用前景。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种检测蛋白酶的巨磁阻生物传感器，包括巨磁阻生物传感器、镀有金膜的玻璃片、功能多肽和金属离子螯合磁珠；
2、其中，所述镀有金膜的玻璃片固定在巨磁阻传感器上，所述功能多肽的氨基酸序列，中间包含蛋白酶的识别肽段，碳端或氮端为含有巯基的半胱胺酸残基，另一端则为his标签，所述的功能多肽通过半胱胺酸残基上的巯基与镀有金膜的玻璃片连接，所述的功能多肽通过his标签与金属离子螯合磁珠连接。
3、优选的，所述的金属离子螯合磁珠中的金属离子为co2+或ni2+。
4、优选的，所述功能多肽包含的蛋白酶识别肽段，包括胰蛋白酶的识别肽段、基质金属蛋白酶-2的识别肽段、基质金属蛋白酶-7的识别肽段、基质金属蛋白酶-9的识别肽段和β-分泌酶的识别肽段中的任意一种。
5、优选的，所述识别β-分泌酶的功能多肽氨基酸序列为：a.cys-leu--gly-gly-glu-val-asn-leu-asp-ala-phe-gly-gly--leu-his-his-his-his-his-his ， b.cys-asp-asp-asp-glu-val-asn-leu-asp-ala-phe-asp-asp-asp-his-his-his-his-his-his ，c.cys-arg-pro-pro-val-asn-leu-asp-ala-phe-pro-pro-lys-his-his-his-his-his-his中的任一所示；
6、优选的，所述识别胰蛋白酶的功能多肽氨基酸序列a.cys-leu-gly-gly-lys-gly-ala-lys-gly-tyr-gly-gly--his-his-his-his-his-his，b.cys-asp-asp-arg-cys-phe-arg-gly-gly-asp-asp-his-his-his-his-his-his中的任一所示；
7、优选的，所述识别基质金属蛋白酶-2的功能多肽氨基酸序列为a.cys-leu-gly-pro-leu-gly-val-arg-gly-gly-gly-gly-leu-his-his-his-his-his-his，b.cys-gly-pro-pro-gly-val-val-gly-glu-lys-gly-glu-gln-his-his-his-his-his-his中的任一所示；
8、优选的，所述识别基质金属蛋白酶-7的功能多肽氨基酸序列为a.cys-leu-lys-gly-met-thr-leu-ser-leu-pro-val-his-his-his-his-his-his，b.cys-leu-gly-val-pro-leu-ser本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测蛋白酶的巨磁阻生物传感器，其特征在于，包括巨磁阻传感器、镀有金膜的玻璃片、功能多肽和金属离子螯合磁珠；
2.如权利要求1所述的巨磁阻生物传感器，其特征在于，所述蛋白酶的识别肽段包括β-分泌酶的识别肽段、胰蛋白酶的识别肽段、基质金属蛋白酶-2的识别肽段、基质金属蛋白酶-7的识别肽段和基质金属蛋白酶-9的识别肽段中的任意一种。
3.如权利要求1所述的巨磁阻生物传感器，其特征在于，所述的金属离子螯合磁珠中的金属离子为Co2+或Ni2+。
4.如权利要求1-3任一项所述巨磁阻生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的磷酸缓冲盐溶液的pH＝7.4，包含10mmol/L PBS和0.1％Tween-20，溶液中功能多肽浓度为1μmol/L～6μmol/L。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述金属离子螯合磁珠浓度为0.005mg/mL～0.05mg/mL，平均粒径大小为200nm-1μm，与多肽反应时间为20-60min。
<...【技术特征摘要】
1.一种检测蛋白酶的巨磁阻生物传感器，其特征在于，包括巨磁阻传感器、镀有金膜的玻璃片、功能多肽和金属离子螯合磁珠；
2.如权利要求1所述的巨磁阻生物传感器，其特征在于，所述蛋白酶的识别肽段包括β-分泌酶的识别肽段、胰蛋白酶的识别肽段、基质金属蛋白酶-2的识别肽段、基质金属蛋白酶-7的识别肽段和基质金属蛋白酶-9的识别肽段中的任意一种。
3.如权利要求1所述的巨磁阻生物传感器，其特征在于，所述的金属离子螯合磁珠中的金属离子为co2+或ni2+。
4.如权利要求1-3任一项所述巨磁阻生物传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的磷酸缓冲盐溶液的ph＝7.4，包含10mm...
【专利技术属性】
技术研发人员：左显维，王焱，徐武德，冯治棋，刘春燕，刘一丹，李昕，何欣，
申请(专利权)人：甘肃省科学院传感技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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