【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及活性物质提取及应用，具体为一种从解淀粉芽孢杆菌发酵液中提取抗菌脂肽的方法及脂肽鉴定方法。
技术介绍
1、病原微生物常寄生在植物体内、果蔬伤口，会引起植物病害和果蔬腐败，导致作物生长缓慢、减产，引起果蔬外观、气味、色泽改变，造成食物中毒或过敏。突尼斯每年因镰刀菌感染引发的根腐病使硬质小麦减产高达产量的26％。全球20％～30％的果蔬在生产、运输、销售和贮藏的过程中因病原微生物感染腐败而损失。化学防霉腐剂能有效控制病原微生物感染，但是长期使用化学杀菌剂容易引起病原微生物产生抗药性而降低了防效。另外，生产上频繁和高浓度地使用化学杀菌剂会造成农药残留和环境污染，存在食品和环境安全风险。因此，发展无公害型生物农药用于抑制腐败和植物病害成为解决问题最有效的途径之一。
2、芽孢杆菌是广泛存在于土壤、水体和植物表面等自然界环境中的一类营腐生活的革兰氏阳性细菌。该属中多个种可产生抗菌蛋白、脂肽类抗生素、聚酮类抗生素的抗菌活性物质。其中，从土壤中分离得到的解淀粉芽孢杆菌菌株met0908能产生抗真菌蛋白，作用于炭疽病菌的细胞壁，进而抑制其生长。此外，芽孢杆菌还能产生伊枯草菌素a(itufin a)、表面活性素(surfactin)、丰原素(fengycin)及芽孢菌素d等脂肽类抗生素。脂肽抗生素是一些由7～l0个氨基酸和一个c13-18的脂肪酸链构成的环形化合物，包括表面活性素、丰原素、伊枯草菌素，其中丰原素和伊枯草菌素能改变真菌细胞膜的表面张力，形成微孔，导致真菌细胞内k+及其它重要离子渗漏，引起病原真菌细胞死亡。因此，
技术实现思路
1、针对现有技术存在的缺陷和不足，本专利技术提供了一种从解淀粉芽孢杆菌发酵液中提取抗菌脂肽的方法及脂肽鉴定方法。
2、为了实现上述目的，提供的技术方案如下：
3、一种从解淀粉芽孢杆菌发酵液中提取抗菌脂肽的方法，所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)lut-y1，保藏编号为cgmcc no.20462；其特征在于，包括以下步骤：
4、步骤一、将解淀粉芽孢杆菌种子培养物以1％～10％(v/v)的接种量接种于发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；
5、步骤二、停止发酵后，将菌株发酵液于4℃进行离心处理，收集上清液，用hcl调至ph为2～4，4℃冰箱静置过夜；于4℃进行离心处理，收集沉淀并干燥；用甲醇抽提沉淀2～5h，重复三次，合并三次提取液，用naoh调节抽提液的ph至5.5～8.5；通过旋转蒸发仪在20～80℃条件下旋转蒸发得到提取物。
6、优选的，在步骤一中，所述发酵培养基由以下原料组成：蛋白胨10～30g/l，可溶性淀粉10～30g/l，nah2po4·2h2o 1～3g/l，na2hpo4·2h2o 1～5g/l，mgso4·7h2o 1～3g，zncl21～3g/l。
7、优选的，在步骤一中，所述发酵的条件为：ph为5.5～8.5，装液量为130～170ml，在20～40℃培养64h。
8、优选的，在步骤二中，所述hcl的浓度为4～8mol/l；所述naoh的浓度为4～7mol/l；所述离心处理的条件均为8000～10000rpm离心10min。
9、一种脂肽鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
10、步骤一、将得到的提取物经过薄层层析和茚三酮显色后出现一个斑点，再经过原位酸水解、茚三酮显色后出现2个新斑点，说明提取物为环肽类化合物；薄层层析展开剂采用正丁醇∶冰醋酸∶水＝3～6∶1∶1(v/v)。
11、步骤二、将得到的提取物的水溶液滴入油膜，出现明显的排油圈，说明该提取物含有亲油基团；
12、步骤三、傅里叶红外光谱分析表明提取物中含有酰胺、酯、肽和脂肪族官能团的存在，说明该提取物是一种脂肽；
13、步骤四、提取物经sephadex lh-20柱层析分离出现2个峰，峰1化合物和峰2化合物对链格孢菌均具有明显抑制作用；质谱分析峰1化合物和峰2化合物均为2类脂肽化合物：c13～c15surfactin和c14～c16iturin，但两类脂肽化合物在峰1和峰2中的含量比例不同。
14、优选的，在步骤一中，所述的薄层层析样品间的间隔为1.5cm，样品点直径不超过3mm。
15、优选的，在步骤二中，所述的排油实验染色剂为苏丹ⅲ。
16、优选的，在步骤三中，所述的傅里叶红外光谱扫描范围为100～8000cm-1。
17、优选的，在步骤四中，所述的sephadex lh-20凝胶柱层析流速为5～15min/管，收集60管，用紫外分光光度计测定每管收集液在210nm处的吸光值；所述的质谱检测条件为：离子源h-esi，喷雾电压3.0～4.0kv，鞘气流速40～50psi，辅气流速10～30psi，离子传输管温度300～340℃；全扫描模式，扫描范围m/z：100-8000。
18、本专利技术的有益效果在于：本专利技术提取的活性物质具有抗真菌活性，对于防治植物真菌类病害和防腐剂开发具有潜在的应用价值，且该方法提取的样品纯度高，操作简单，提取过程中能够稳定活性物质，效率高。
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1.一种从解淀粉芽孢杆菌发酵液中提取抗菌脂肽的方法，所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)lut-Y1，保藏编号为CGMCC NO.20462；其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种从解淀粉芽孢杆菌发酵液中提取抗菌脂肽的方法及应用，其特征在于：在步骤一中，所述发酵培养基由以下原料组成：蛋白胨10～30g/L，可溶性淀粉10～30g/L，NaH2PO4·2H2O 1～3g/L，Na2HPO4·2H2O 1～5g/L，MgSO4·7H2O 1～3g，ZnCl21～3g/L。
3.根据权利要求1所述的一种从解淀粉芽孢杆菌发酵液中提取抗菌脂肽的方法及应用，其特征在于：在步骤一中，所述发酵的条件为：pH为5.5～8.5，装液量为130～170mL，在20～40℃培养64h。
4.根据权利要求1所述的一种从解淀粉芽孢杆菌发酵液中提取抗菌脂肽的方法及应用，其特征在于：在步骤二中，所述HCl的浓度为4～8mol/L；所述NaOH的浓度为4～7mol/L；所述离心处理的条件均为8000～100
5.一种脂肽鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
6.根据权利要求5所述的一种脂肽鉴定方法，其特征在于：在步骤一中，所述的薄层层析样品间的间隔为1.5cm，样品点直径不超过3mm。
7.根据权利要求1所述的一种从解淀粉芽孢杆菌发酵液中提取抗菌脂肽的方法及应用，其特征在于：在步骤二中，所述的排油实验染色剂为苏丹Ⅲ。
8.根据权利要求1所述的一种从解淀粉芽孢杆菌发酵液中提取抗菌脂肽的方法及应用，其特征在于：在步骤三中，所述的傅里叶红外光谱扫描范围为100～8000cm-1。
9.根据权利要求1所述的一种从解淀粉芽孢杆菌发酵液中提取抗菌脂肽的方法及应用，其特征在于：在步骤四中，所述的Sephadex LH-20凝胶柱层析流速为5～15min/管，收集60管，用紫外分光光度计测定每管收集液在210nm处的吸光值；所述的质谱检测条件为：离子源H-ESI，喷雾电压3.0～4.0kV，鞘气流速40～50psi，辅气流速10～30psi，离子传输管温度300～340℃；全扫描模式，扫描范围m/z：100-8000。
...【技术特征摘要】
1.一种从解淀粉芽孢杆菌发酵液中提取抗菌脂肽的方法，所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)lut-y1，保藏编号为cgmcc no.20462；其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种从解淀粉芽孢杆菌发酵液中提取抗菌脂肽的方法及应用，其特征在于：在步骤一中，所述发酵培养基由以下原料组成：蛋白胨10～30g/l，可溶性淀粉10～30g/l，nah2po4·2h2o 1～3g/l，na2hpo4·2h2o 1～5g/l，mgso4·7h2o 1～3g，zncl21～3g/l。
3.根据权利要求1所述的一种从解淀粉芽孢杆菌发酵液中提取抗菌脂肽的方法及应用，其特征在于：在步骤一中，所述发酵的条件为：ph为5.5～8.5，装液量为130～170ml，在20～40℃培养64h。
4.根据权利要求1所述的一种从解淀粉芽孢杆菌发酵液中提取抗菌脂肽的方法及应用，其特征在于：在步骤二中，所述hcl的浓度为4～8mol/l；所述naoh的浓度为4～7mol/l；所述离心处理的条件均为8000～10000...
【专利技术属性】
技术研发人员：袁惠君，李彦森，王振东，余诗曼，冯欢，何苗苗，张欢欢，许珊珊，薛浩，
申请(专利权)人：兰州理工大学，
类型：发明
国别省市：
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