【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，尤其是指一种利用乙醇诱导毕赤酵母表达人源α-乳白蛋白的方法。
技术介绍
1、巴斯德毕赤酵母(pichia pastoris，又名komagataella phaffii)表达系统是目前工业和医药领域最常用的表达系统之一，被广泛用于外源蛋白的表达。巴斯德毕赤酵母作为单细胞真核生物具有许多优点：(1)毕赤酵母相比于原核表达系统更利于蛋白质的折叠、加工和翻译后修饰；(2)毕赤酵母相比于杆状病毒和哺乳动物组织培养等真核表达系统更加快捷、简单以及廉价，并且外源蛋白表达水平更高；(3)毕赤酵母的醇氧化酶基因的启动子具有强诱导性和强启动性，适于外源基因的高水平诱导表达；(4)毕赤酵母具有好氧生长偏爱性，适合进行细胞高密度培养，利于大规模工业化生产；(5)毕赤酵母内源分泌的蛋白量极少，分泌表达的外源蛋白最高可以占到总分泌蛋白的90％，有利于后续的提纯。
2、甲醇是毕赤酵母表达系统中最常用的诱导剂。甲醇诱导的醇氧化酶启动子(aox1)能够大量表达醇氧化酶，从而驱动外源蛋白的表达。然而，甲醇的使用也存在一些缺点。甲醇作为毕赤酵母的唯一碳源时，虽然可以诱导外源蛋白的表达，但也可能对酵母细胞产生一定的压力，从而影响细胞的生长和蛋白的表达效率。甲醇的浓度、添加时机和方式等都会影响外源蛋白的表达水平，因此需要对这些参数进行精细控制，增加了操作的复杂性和成本。除此之外，甲醇是一种有毒物质，过量摄入可能导致失明等严重后果，因此在利用毕赤酵母表达系统生产口服药物或食品蛋白时，甲醇作为诱导物的使用往往不被人们接受。
4、目前虽然已经实现人α-la在毕赤酵母中的表达，但是仍面临着分泌产量较低以及甲醇作为诱导剂存在毒性的问题。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种利用乙醇诱导毕赤酵母表达人源α-乳白蛋白的方法，本专利技术构建了一株利用乙醇作为诱导剂，异源表达人源α-乳白蛋白的重组毕赤酵母，构建过程使用了三种不同的表达载体，其中第一表达载体使用乙醇诱导型启动子表达dna结合蛋白和转录激活因子的融合多肽，第二表达载体依次表达蛋白结合序列、甲醇诱导型启动子、α信号肽和人源α-乳白蛋白，第三表达载体过表达参与蛋白质靶向内质网的信号识别颗粒亚基，可将构建得到的重组毕赤酵母应用于无甲醇发酵生产人源α-乳白蛋白。
2、本专利技术的第一个目的是提供一种表达人源α-乳白蛋白的重组毕赤酵母，所述重组毕赤酵母中含有第一表达盒、第二表达盒和第三表达盒，其中：
3、所述第一表达盒使用乙醇诱导型启动子表达dna结合蛋白和转录激活因子的融合多肽；
4、所述第二表达盒依次表达蛋白结合序列、甲醇诱导型启动子、α信号肽和人源α-乳白蛋白，所述蛋白结合序列为laco；
5、所述第三表达盒过表达信号识别颗粒亚基，所述信号识别颗粒亚基参与蛋白质靶向内质网。
6、进一步地，所述重组毕赤酵母以毕赤酵母gs115为底盘菌株。
7、进一步地，第一表达盒中，所述乙醇诱导型启动子为icl1，所述dna结合蛋白为laci，所述转录激活因子为mit1ad。
8、进一步地，第二表达盒中，所述蛋白结合序列的拷贝数为5。
9、进一步地，第二表达盒中，所述α信号肽的pre区替换为血清白蛋白信号肽、杀伤蛋白信号肽、ost1信号肽或epx1信号肽。
10、优选地，第二表达盒中，所述α信号肽的pre区替换为血清白蛋白信号肽
11、进一步地，所述第二表达盒在所述重组毕赤酵母中的拷贝数为1-5。
12、优选地，所述第二表达盒在所述重组毕赤酵母中的拷贝数为3.
13、本专利技术的第二个目的是提供一种用于构建上述重组毕赤酵母的表达载体组合，所述表达载体组合包括第一表达载体、第二表达载体和第三表达载体，其中：
14、所述第一表达载体使用乙醇诱导型启动子表达dna结合蛋白和转录激活因子的融合多肽；
15、所述第二表达载体依次表达蛋白结合序列、甲醇诱导型启动子、α信号肽和人源α-乳白蛋白，所述蛋白结合序列为laco；
16、所述第三表达载体过表达信号识别颗粒亚基，所述信号识别颗粒亚基参与蛋白质靶向内质网。
17、本专利技术的第三个目的是提供一种利用乙醇诱导毕赤酵母表达人源α-乳白蛋白的方法，包括以下步骤：
18、步骤s1、构建上述重组毕赤酵母，得到种子液；
19、步骤s2、发酵罐中添加发酵基础盐培养基和ptm1微量元素液，将种子液接种至发酵罐中，使溶氧保持在20％以上；
20、步骤s3、溶氧反弹后进行甘油补料，之后使用乙醇溶液进行诱导；
21、步骤s4、交替进行乙醇补料和甘油补料至发酵结束。
22、进一步地，所述甘油和乙醇中均添加ptm1微量元素液。
23、优选地，甘油和乙醇中ptm1微量元素液的添加量为12ml/l。
24、进一步地，步骤s4期间监控发酵液中的乙酸浓度，乙酸积累时停止乙醇补料，进行甘油补料。
25、本专利技术的有益效果：
26、本专利技术构建的毕赤酵母菌株使用乙醇作为诱导剂分泌表达分泌型人源α-la，摇瓶发酵产量为23.3mg/l，在3l发酵罐中产量达到1.1g/l，且发酵过程无需添加甲醇作为诱导剂，避免了甲醇可能造成的毒性和安全问题，实现了人源α-乳白蛋白的高效生产。为人源α-la的大规模无甲醇生产奠定了理论基础，推动了人源α-乳白蛋白在毕赤酵母中无甲醇生产技术的发展，为模拟母乳的婴儿配方奶粉和开发生物工程乳提供了新的进展。
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1.一种表达人源α-乳白蛋白的重组毕赤酵母，其特征在于，所述重组毕赤酵母中含有第一表达盒、第二表达盒和第三表达盒，其中：
2.根据权利要求1所述的重组毕赤酵母，其特征在于：所述重组毕赤酵母以毕赤酵母GS115为底盘菌株。
3.根据权利要求1所述的重组毕赤酵母，其特征在于：第一表达盒中，所述乙醇诱导型启动子为ICL1，所述DNA结合蛋白为LacI，所述转录激活因子为Mit1AD。
4.根据权利要求1所述的重组毕赤酵母，其特征在于：第二表达盒中，所述蛋白结合序列的拷贝数为5。
5.根据权利要求1所述的重组毕赤酵母，其特征在于：第二表达盒中，所述α信号肽的pre区替换为血清白蛋白信号肽、杀伤蛋白信号肽、Ost1信号肽或Epx1信号肽。
6.根据权利要求1所述的重组毕赤酵母，其特征在于：所述第二表达盒在所述重组毕赤酵母中的拷贝数为1-5。
7.一种用于构建权利要求1-6任一所述重组毕赤酵母的表达载体组合，其特征在于，所述表达载体组合包括第一表达载体、第二表达载体和第三表达载体，其中：
8.一种利用乙醇诱导
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述甘油和乙醇中均添加PTM1微量元素液。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤S4期间监控发酵液中的乙酸浓度，乙酸积累时停止乙醇补料，进行甘油补料。
...【技术特征摘要】
1.一种表达人源α-乳白蛋白的重组毕赤酵母，其特征在于，所述重组毕赤酵母中含有第一表达盒、第二表达盒和第三表达盒，其中：
2.根据权利要求1所述的重组毕赤酵母，其特征在于：所述重组毕赤酵母以毕赤酵母gs115为底盘菌株。
3.根据权利要求1所述的重组毕赤酵母，其特征在于：第一表达盒中，所述乙醇诱导型启动子为icl1，所述dna结合蛋白为laci，所述转录激活因子为mit1ad。
4.根据权利要求1所述的重组毕赤酵母，其特征在于：第二表达盒中，所述蛋白结合序列的拷贝数为5。
5.根据权利要求1所述的重组毕赤酵母，其特征在于：第二表达盒中，所述α信号肽的pre区替换为血清白蛋白信号肽、杀伤蛋白...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘延峰，陈坚，王昕毅，刘龙，吕雪芹，堵国成，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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