【技术实现步骤摘要】
本申请涉及体外细胞基因转染，具体涉及转染复合物制备方法及应用。
技术介绍
1、病毒包装是生物医学研究和基因治疗领域中的关键步骤。涉及将目的基因插入病毒载体，并在宿主细胞中制备病毒颗粒，以用于基因传递和表达。为了成功进行病毒包装，需要高效的转染试剂，以确保质粒(包括载体质粒、包膜质粒、包装质粒等)在宿主细胞内被共转染，形成功能完整的病毒载体。
2、传统上，阳离子脂质体是常用的转染试剂之一，它们具有带正电荷的脂质结构，可与质粒的负电荷相互吸引，促进质粒的内源性吸收。另一种常用的转染试剂是pei阳离子聚合物，其具有优异的转染效率和稳定性，被广泛应用于病毒包装和基因转染领域。
3、转染复合物的制备过程通常涉及将小体积的载体溶液与大体积的质粒溶液混合，通过倒置容器等方式实现均匀混合，然后静置孵育，以便形成高效的病毒载体。然而，现有的转染复合物制备方法转染效率低等问题。
4、为此，本申请提出了一种新型转染复合物制备方法。
技术实现思路
1、本申请是专利技术人基于下列发现完成的：
2、目前，在制备转染复合物的过程中，通常采用手动混匀的方法，然而，这一步骤常常导致复合物的粒度分布不均匀，其聚集度较高(pdi＞0.35)。根据动态光散射粒度分析标准iso 22412:2017，pdi值小于0.1时，样品被视为具有单分散性。然而，由于手动混匀方法的局限性，导致复合物的分散性较差，不满足单分散性的要求。
3、本申请旨在至少解决现有技术中存在的技
4、在本申请的第一方面，本申请提出了一种转染复合物制备方法。根据本申请的实施例，该方法包括：利用微流控设备对转染试剂和待转染质粒进行第一混合处理，以便获得转染复合物；其中，所述待转染质粒与所述转染试剂的质量体积比为1mg:1ml～1mg:3ml。
5、根据本申请的实施例，通过本方法制备的转染复合物粒度均一性较好，转染效率更高。
6、根据本申请的实施例，上述方法还包括下列技术特征的至少之一：
7、根据本申请的实施例，所述转染试剂通过无血清培养基稀释。由于转染试剂中一般包含阳离子化合物，如pei(聚乙烯亚胺)等，具有一定的细胞毒性。通过将转染试剂与无血清培养基混合稀释，可以降低试剂对细胞的毒性，减少细胞损伤。
8、根据本申请的实施例，所述转染试剂在所述无血清培养基中的稀释比例为1:20～1:40。在本申请的一些示例中，所述转染试剂在所述无血清培养基中的稀释比例可选地为1:21、1:22、1:23、1:24、1:25、1:26、1:27、1:28、1:29、1:30、1:31、1:32、1:33、1:34、1:35、1:36、1:37、1:38、1:39、1:40。
9、根据本申请的实施例，所述转染试剂在所述无血清培养基中的稀释比例为1:25。专利技术人经过大量实验验证发现，转染试剂在无血清培养基中的稀释比例为1:25时，具有更高的转染效率。
10、根据本申请的实施例，所述质粒是以溶解在无血清培养基中的形式提供的。
11、根据本申请的实施例，所述质粒在所述无血清培养基中的浓度为0.02～0.06mg/ml。在本申请的一些示例中，所述质粒在所述无血清培养基中的浓度可选地为0.02mg/ml、0.03mg/ml、0.04mg/ml、0.05mg/ml、0.06mg/ml。
12、根据本申请的实施例，所述质粒在所述无血清培养基中的浓度为0.04mg/ml。质粒浓度的高低会直接影响质粒dna进入目标细胞的能力，进而影响转染效率。专利技术人经过大量实验验证发现，所述质粒在所述无血清培养基中的浓度为0.04mg/ml时具有更高的转染效率。
13、根据本申请的实施例，所述微流控设备参数包括：流速为18ml/min，总流量为1.2～12ml，为0.35～0.9ml，后废液为0.2～0.4ml。在本申请的一些示例中，专利技术人对微流控设备的总流量(1.2ml、1.5ml、3ml、4.5ml、6ml、7.5ml、9ml、12ml)、前废液(0.35ml、0.5ml、0.75ml、0.9ml)、后废液(0.2ml、0.3ml、0.4ml)进行了梯度筛选，最终发现在流速为18ml/min，总流量为1.2～12ml，为0.35～0.9ml，后废液为0.2～0.4ml范围内，均能够获得粒度均一的转染复合物。
14、根据本申请的实施例，所述质粒与所述转染试剂的质量体积比为1mg:1ml～1mg:1ml。在本申请的一些优选示例中，质粒与转染试剂的质量体积比为1mg:1ml～1mg:1ml时，转染效率最高。
15、根据本申请的实施例，所述转染试剂为聚乙烯亚胺(pei)。
16、根据本申请的实施例，所述转染复合物粒径不大于100nm。在本申请的一些示例中，需要将转染复合物输送至细胞核内进行表达，细胞核孔约为100nm，与之粒径大小相近的转染复合物可运载较多质粒，并携带质粒顺利进入细胞核。而超过100nm的转染复合物则无法通过核孔。
17、根据本申请的实施例，所述待转染质粒选自pspax2、pmd2.g和capn3中的至少之一。
18、在本申请的第二方面，本申请提出了一种转染复合物。根据本申请的实施例，所述转染复合物通过第一方面所述的方法或本申请第一方面所述的任一实施例制备获得。根据本申请的实施例，所述转染复合物粒度均一，具有良好的转染效率。
19、在本申请的第三方面，本申请提出了一种转染细胞的方法。根据本申请的实施例，包括利用本申请第二方面所述的转染复合物对所述待转染细胞进行转染处理。根据本申请的实施例，所述方法能够实现细胞的高效转染。
20、根据本申请的实施例，所述转染细胞的方法还包括下列技术特征的至少之一：
21、根据本申请的实施例，在进行转染处理前，进一步包括将所述转染复合物在室温静置10～20分钟。在本申请的一些实例中，通过静置让转染试剂和质粒相互作用，形成稳定的转染复合物，从而提高转染效率。
22、在本申请的第四方面，本申请提出了一种收获病毒的方法。根据本申请的实施例，所述方法包括：将本申请第二方面所述的转染复合物对所述待转染细胞进行转染处理；将转染处理后的细胞在适于细胞生长的条件下进行培养处理，以便收获病毒。根据本申请的实施例，利用转染复合物转染细胞收获病毒可以增加病毒产量。
23、根据本申请的实施例，所述收获病毒的方法还包括下列技术特征的至少之一：
24、根据本申请的实施例，所述培养处理是在25℃，5％ co2条件下进行的。
25、根据本申请的实施例，所述培养处理时间为72～96小时。在本申请的一些示例中，可基于实验需求调整培养处理的时间。
26、需要说明的是，在本申请中，针对上述任一方面、任一实施方式或实施例中的方法、本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种转染复合物制备方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转染试剂通过无血清培养基稀释；
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质粒是以溶解在无血清培养基中的形式提供的；
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微流控设备参数包括：流速为18ml/min，总流量为1.2～12ml，前废液为0.35～0.9ml，后废液为0.2～0.4ml。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质粒与所述转染试剂的质量体积比为1mg:1mL～1mg:1mL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转染试剂为聚乙烯亚胺。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转染复合物粒径不大于100nm。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待转染质粒选自PSPAX2、PMD2.G和CAPN3中的至少之一。
9.一种转染复合物，其特征在于，所述转染复合物通过权利要求1～8任一项所述的方法制备获得。
10.一种转染细胞的方法，
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，在进行转染处理前，进一步包括将所述转染复合物在室温静置10～20分钟。
12.一种收获病毒方法，其特征在于，包括：
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述培养处理是在25℃，5％CO2条件下进行的；
...【技术特征摘要】
1.一种转染复合物制备方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转染试剂通过无血清培养基稀释；
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质粒是以溶解在无血清培养基中的形式提供的；
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微流控设备参数包括：流速为18ml/min，总流量为1.2～12ml，前废液为0.35～0.9ml，后废液为0.2～0.4ml。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质粒与所述转染试剂的质量体积比为1mg:1ml～1mg:1ml。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转染试剂为聚乙烯亚胺。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋云，邹婉婷，张玉蕊，付小龙，
申请(专利权)人：北京荷塘生华医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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