【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物领域，具体涉及一种基因工程菌及用其合成虾青素的方法。
技术介绍
1、虾青素是一种酮式类胡萝卜素，具有较强的抗氧化活性，其氧化活性是β-胡萝卜素、叶黄素和番茄红素等其它类胡萝卜素的100倍，因此，虾青素被广泛应用于动物饲料、食品色素、保健和化妆品等行业，具有较高的市场价值，预计到2027年其市场价值将增长到近34亿美元。目前虾青素的来源主要是天然提取和人工合成，天然提取是指从雨生红球藻、红发夫酵母及水生动物等中获得；人工合成包括化学合成和生物合成，其中化学合成是虾青素的主要合成途径，但化学合成的虾青素具有高副产物和低活性的特性，与之相比的生物合成具有更环保、安全的独特优势。
2、生物合成是指通过基因工程对一些模式底盘菌株进行改造并使其成功表达虾青素的技术，常见的模式菌株主要是酵母和大肠杆菌[4]。与大肠杆菌相比，酿酒酵母是公认安全的微生物菌株，含有甲羟戊酸（mva）途径，可为虾青素等萜类化合物合成提供直接前体物质牻牛儿基焦磷酸(gpp)、法尼基焦磷酸(fpp)、双(牻牛儿基)二磷酸盐(ggpp)和角鲨烯环氧化物，因此其在异源合成虾青素等萜类化合物方面具有天然优势。
3、虾青素的合成产量是限制其工业化生产的主要因素，目前通过一些代谢工程方式可以进一步提高虾青素的产量，如启动子优化、mva路径增强、脂滴调控、关键基因拷贝数增加、同源酶优化、菌株随机诱变等，其中优化同源酶是获得初始高产虾青素表达菌株底盘的关键点，因此，本研究将通过组合不同来源同源酶的策略优化提升酿酒酵母合成虾青素的产量，旨在进
4、现有技术缺点如下：
5、1. 虾青素代谢强化调控策略较分散，产量提升幅度较低：目前虾青素生物合成研究主要基于少数代谢调控策略组合强化，调控方向不集中，且对虾青素合成代谢路径同源酶做全路径优化的研究较少。
6、2. 酵母生物合成虾青素稳定性较低，大规模工业化发酵难点较大：现有研究大多将虾青素异源合成基因组装于质粒载体进行表达，虽然可快速表达目标化合物，但后期发酵必须使用缺陷型培养基或抗生素以保证质粒复制，这不仅影响菌株的生长活性，还不利于下游发酵提纯研究。
7、3. 虾青素生物合成的主要模式底盘菌株是酵母和大肠杆菌，大肠杆菌的工程改造相比酵母来说更简单便捷，但其具有内源性毒素，这对后期虾青素的发酵提取工艺和产业化标准要求更严格。
技术实现思路
1、为了提高虾青素的产量、解决酵母生物合成中存在的酵母活性受限、难以提纯以及大肠杆菌带来的毒性问题，本专利技术提供了一种基因工程菌及用其合成虾青素的方法。
2、本专利技术旨在通过crispr-cas9基因编辑技术对酿酒酵母进行工程改造，使得酿酒酵母获得异源表达虾青素的能力，同时通过模块化优化同源酶组合方式，即优化β-胡萝卜素同源酶表达和优化crtz和crtw/bkt组合等策略提高酿酒酵母胞内合成虾青素的产量，从而进一步推动生物合成虾青素的工业化发展。
3、本专利技术的专利技术点主要包括以下几个方面：
4、a. 模块化优化虾青素合成的同源酶组合：本专利技术通过优化八氢番茄红素合成酶、番茄红素环化酶和八氢番茄红素脱氢酶组合获得高产β-胡萝卜素菌株底盘，并在高产β-胡萝卜素基础上进一步优化crtz和crtw/bkt组合，同源酶优化组合覆盖了虾青素合成通路全路径，这为虾青素合成同源酶选择提供重要的参考依据。
5、b. 构建工程菌株可稳定遗传表达虾青素：本专利技术利用crispr/cas9基因编辑技术将虾青素异源表达基因插入酵母基因组中，使得构建的工程菌株遗传性能稳定，有利于虾青素大规模发酵的产业化研究。
6、通过以上步骤，本专利技术利用crispr/cas9基因编辑技术将模块化优化虾青素合成同源酶的最优组合进行基因组整合表达，从而获得一株高产虾青素且可稳定遗传表达的工程菌株，这为虾青素的同源酶选择提供重要的借鉴方案。
7、本专利技术第一方面提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌为在出发菌株中表达crte基因、carrp基因和carb基因。
8、在本专利技术的一些实施方案中，所述crte基因、carrp基因和carb基因的核苷酸序列分别如seq id no: 1、seq id no: 2和seq id no: 3所示。
9、在本专利技术的一些实施方案中，所述基因工程菌还表达crtz基因和crtw基因。
10、在本专利技术的一些优选实施方案中，所述crtz和crtw的核苷酸序列分别如seq idno: 4和seq id no: 5所示。
11、在本专利技术的一些实施方案中，所述出发菌株为酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）。
12、在本专利技术的一些优选实施方案中，所述酵母菌为matα his3δ1 leu2δ0 ura3δ0synlys2, met15, ho::sup61 synii, syniii, synvi, synixr。
13、2369r为现有菌株，已在doi: 10.1016/j.cell.2023.09.025. epub 2023 nov 8.pmid: 37944511公开。
14、在本专利技术的一些实施方案中，所述crte基因、carrp基因、carb基因、crtz基因和crtw基因插入到所述出发菌株的基因组中。
15、在本专利技术的一些优选实施方案中，所述插入的位点选自以下一种或多种：
16、所述crte基因插入所述酿酒酵母第x条染色体的lsb6和gsh1基因之间；
17、所述carrp基因插入所述酿酒酵母第iv染色体的rpo21和scm3基因之间；
18、所述carb基因插入所述酿酒酵母第xiv染色体的ipi3和pbr1基因之间；
19、所述crtz基因插入所述酿酒酵母第xiii染色体的sok2和spo20基因之间；
20、所述crtw基因插入所述酿酒酵母第xii染色体的rps25b和nup2基因之间。
21、本专利技术第二方面提供了一种合成虾青素的方法，所述方法包括：使用如本专利技术第一方面所述的基因工程菌进行发酵。
22、在本专利技术的一些优选实施方案中，所述发酵为摇瓶发酵或发酵罐发酵。
23、在本专利技术的一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：将所述的基因工程菌接种至发酵培养基中进行发酵培养。
24、在本专利技术的一些优选实施方案中，所述发酵培养基为sc液体培养基或ypd液体培养基，例如ypd液体培养基。
25、在本专利技术的一些实施方案中，所述发酵的条件包括以下一种或多种：
26、温度为28-37℃，例如30℃；
27、摇速为0-400rpm，例如为220rpm；
28、发酵时间为1-5d，例如为3d。
29、在本专利技术的一些实施方案中，在接种至发酵培养基前还包括接种至种本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为在出发菌株中表达CrtE基因、CarRP基因和CarB基因，所述CrtE基因、CarRP基因和CarB基因的核苷酸序列分别如SEQ IDNO: 1、SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3所示。
2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌还表达CrtZ基因和CrtW基因，所述CrtZ和CrtW的核苷酸序列分别如SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 5所示。
3.如权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述出发菌株为酿酒酵母。
4.如权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母为MATα his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 synLYS2, MET15, HO::SUP61 synII, synIII, synVI, synIXR。
5.如权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述CrtE基因、CarRP基因、CarB基因、CrtZ基因和CrtW基因插入到所述出发菌株的基因组中；其中：
6.一种合成虾青素的方法，其特
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将所述的基因工程菌接种至发酵培养基中进行发酵培养。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，在接种至发酵培养基前还包括接种至种子培养基中过夜培养；
9.一种组合物，其特征在于，所述组合物包含CrtE基因、CarRP基因和CarB基因或其翻译的酶，所述CrtE基因、CarRP基因和CarB基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO: 1、SEQ IDNO: 2和SEQ ID NO: 3所示；所述酶的氨基酸序列由如SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2和SEQID NO: 3所示的核苷酸序列翻译而来。
10.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含CrtZ基因和CrtW基因或其翻译的酶，所述CrtZ基因和CrtW基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO: 4和5所示；所述酶的氨基酸序列由如SEQ ID NO: 4和5所示的核苷酸序列翻译而来。
11.如权利要求1-5任一项所述的基因工程菌或如权利要求9或10所述的组合物在生产虾青素中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为在出发菌株中表达crte基因、carrp基因和carb基因，所述crte基因、carrp基因和carb基因的核苷酸序列分别如seq idno: 1、seq id no: 2和seq id no: 3所示。
2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌还表达crtz基因和crtw基因，所述crtz和crtw的核苷酸序列分别如seq id no: 4和seq id no: 5所示。
3.如权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述出发菌株为酿酒酵母。
4.如权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母为matα his3δ1 leu2δ0 ura3δ0 synlys2, met15, ho::sup61 synii, syniii, synvi, synixr。
5.如权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述crte基因、carrp基因、carb基因、crtz基因和crtw基因插入到所述出发菌株的基因组中；其中：
6.一种合成虾青素的方法，其特征在于，所述方法包括：使用如权利要求1-...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭水连，陈海新，方晓东，张旭，
申请(专利权)人：三亚华大生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。